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目的
检测SDPR基因在人肺癌中的表达水平和甲基化状态；研究SDPR对非小细胞肺癌细胞生物学作用的影响；探讨SDPR对紫杉醇、5-氟嘧啶和顺铂三种化疗药物在非小细胞肺癌中作用；初步探索SDPR在非小细胞肺癌中发挥抑癌作用的潜在机制。
方法
1.人肺癌组织和人肺癌细胞系中SDPR表达水平检测：以肺癌患者癌组织和癌旁组织为研究对象，采用免疫组化检测组织中SDPR的表达水平。通过RT-PCR检测6种人肺癌细胞系(H1299、H2122、H358、H446、H460、A549)和正常肺组织中SDPRmRNA的水平。
2.SDPR在肺癌中甲基化状态：通过MSP对上述细胞、支气管灌洗液的甲基化状态进行检测，从而明确SDPR沉默是否与其甲基化相关。
3.转染(过表达/沉默)效率验证：携带人SDPR过表达基因的重组质粒M98-SDPR及其阴性对照M98-vector和针对SDPR的小干扰RNAsiSDPR及其阴性对照siNC分别用于感染相对低表达和高表达SDPR的人肺癌细胞株，并通过RT-PCR和Westernblot验证过表达或干扰效果。
4.SDPR对NSCLC生物学作用的影响：通过CCK8、克隆形成、Transwell小室法、流式细胞术(FCM)和AO/EB检测肺癌细胞的生物学功能。通过动物实验，验证SDPR在体内抑制作用。
5.SDPR对肺癌细胞紫杉醇、5-氟嘧啶和顺铂的化疗敏感性影响：采用CCK8检测药物处理后的吸光度(450nm)，并基于吸光度计算抑制率，从而明确SDPR在化疗中的增敏作用。
6.SDPR在非小细胞肺癌的机制研究：采用Westernblot检测周期相关蛋白以及p53/p21的表达水平，从而反映SDPR作用于人肺癌细胞的信号通路。
结果
1.SDPR在肺癌组织中的蛋白表达量显著低于癌旁。同时检测肺癌和非癌患者的支气管灌洗液，仅在肺癌患者中发现SDPR的甲基化。对肺癌细胞进行MSP，发现正常肺组织(LN)SDPR没有甲基化，而多数肺癌细胞却发生了SDPR的甲基化。
2.M98-Vector与M98-SDPR分别转染H1299细胞，siNC与siSDPR分别转染A549细胞。RT-PCR和Westernblot结果证实，SDPR在H1299和A549细胞中成功过表达/沉默。
3.CCK8检测结果显示，异位表达的SDPR导致H1299细胞生长显著降低，而siRNA介导的SDPR的沉默导致A549细胞生长明显增加，差异有统计学意义(P＜0.05)。过表达的SDPR致使H1299细胞的集落形成能力降低(P＜0.001)，SDPR的沉默导致A549细胞集落形成能力增加(P＜0.001)。Transwell结果表明，异位表达SDPR能减弱H1299细胞的迁移和侵袭。而沉默SDPR能增强A549细胞的迁移和侵袭。FCM结果证实SDPR过表达能诱导细胞周期停滞在G2/M期。
AO/EB和FCM分析显示，分别用M98-SDPR和M98-vector转染H1299细胞，M98-SDPR组H1299细胞的凋亡率显著高于M98-vector组，差异具有统计学意义(P＜0.05)。分别用siNC和siSDPR转染A549细胞，从AO/EB染色后的图像中可以看出，siSDPR组A549细胞凋亡率明显比siNC组低(P＜0.01)。
4.通过动物实验，我们发现M98-vector组和M98-SDPR组均可在体内成瘤。通过剥离小鼠体内肿瘤并测量其体重，我们发M98-vector组瘤体重量明显高于过表达组(P＜0.05)。通过对肿瘤生长曲线进行绘制，我们观察到M98-SDPR组肿瘤的增殖速度被显著阻抑(P＜0.01)。免疫组化和苏木精-伊红染色结果显示：在SDPR过表达组中细胞增殖标记物Ki-67表达降低，核碎裂增强。进一步分析瘤体成分发现，SDPR能上调P21，下调cyclinB1的mRNA水平。
5.CCK8结果分析显示，SDPR过表达后加强了紫杉醇(PTX)和5-FU对非小细胞肺癌细胞抑制作用(P＜0.05)。沉默SDPR则使这种作用降低(P＜0.05)。同时SDPR对顺铂在NSCLC细胞的作用不具有统计学意义。
6.Westernblot检测结果表明，在p53缺失的H1299细胞中，SDPR可以提高cyclinB1，降低p21和p-cdc2的蛋白水平。相反，在A549细胞中siRNA介导的SDPR沉默会增加cyclinB1，并降低p53，p21和p-cdc2的蛋白表达。
结论
SDPR可以通过启动子甲基化沉默，它是致敏肿瘤细胞重要的抑癌基因，也可能是肺癌诊断重要的甲基化标志物以及潜在的治疗靶点，为肺癌的诊治提供新的线索。
检测SDPR基因在人肺癌中的表达水平和甲基化状态；研究SDPR对非小细胞肺癌细胞生物学作用的影响；探讨SDPR对紫杉醇、5-氟嘧啶和顺铂三种化疗药物在非小细胞肺癌中作用；初步探索SDPR在非小细胞肺癌中发挥抑癌作用的潜在机制。
方法
1.人肺癌组织和人肺癌细胞系中SDPR表达水平检测：以肺癌患者癌组织和癌旁组织为研究对象，采用免疫组化检测组织中SDPR的表达水平。通过RT-PCR检测6种人肺癌细胞系(H1299、H2122、H358、H446、H460、A549)和正常肺组织中SDPRmRNA的水平。
2.SDPR在肺癌中甲基化状态：通过MSP对上述细胞、支气管灌洗液的甲基化状态进行检测，从而明确SDPR沉默是否与其甲基化相关。
3.转染(过表达/沉默)效率验证：携带人SDPR过表达基因的重组质粒M98-SDPR及其阴性对照M98-vector和针对SDPR的小干扰RNAsiSDPR及其阴性对照siNC分别用于感染相对低表达和高表达SDPR的人肺癌细胞株，并通过RT-PCR和Westernblot验证过表达或干扰效果。
4.SDPR对NSCLC生物学作用的影响：通过CCK8、克隆形成、Transwell小室法、流式细胞术(FCM)和AO/EB检测肺癌细胞的生物学功能。通过动物实验，验证SDPR在体内抑制作用。
5.SDPR对肺癌细胞紫杉醇、5-氟嘧啶和顺铂的化疗敏感性影响：采用CCK8检测药物处理后的吸光度(450nm)，并基于吸光度计算抑制率，从而明确SDPR在化疗中的增敏作用。
6.SDPR在非小细胞肺癌的机制研究：采用Westernblot检测周期相关蛋白以及p53/p21的表达水平，从而反映SDPR作用于人肺癌细胞的信号通路。
结果
1.SDPR在肺癌组织中的蛋白表达量显著低于癌旁。同时检测肺癌和非癌患者的支气管灌洗液，仅在肺癌患者中发现SDPR的甲基化。对肺癌细胞进行MSP，发现正常肺组织(LN)SDPR没有甲基化，而多数肺癌细胞却发生了SDPR的甲基化。
2.M98-Vector与M98-SDPR分别转染H1299细胞，siNC与siSDPR分别转染A549细胞。RT-PCR和Westernblot结果证实，SDPR在H1299和A549细胞中成功过表达/沉默。
3.CCK8检测结果显示，异位表达的SDPR导致H1299细胞生长显著降低，而siRNA介导的SDPR的沉默导致A549细胞生长明显增加，差异有统计学意义(P＜0.05)。过表达的SDPR致使H1299细胞的集落形成能力降低(P＜0.001)，SDPR的沉默导致A549细胞集落形成能力增加(P＜0.001)。Transwell结果表明，异位表达SDPR能减弱H1299细胞的迁移和侵袭。而沉默SDPR能增强A549细胞的迁移和侵袭。FCM结果证实SDPR过表达能诱导细胞周期停滞在G2/M期。
AO/EB和FCM分析显示，分别用M98-SDPR和M98-vector转染H1299细胞，M98-SDPR组H1299细胞的凋亡率显著高于M98-vector组，差异具有统计学意义(P＜0.05)。分别用siNC和siSDPR转染A549细胞，从AO/EB染色后的图像中可以看出，siSDPR组A549细胞凋亡率明显比siNC组低(P＜0.01)。
4.通过动物实验，我们发现M98-vector组和M98-SDPR组均可在体内成瘤。通过剥离小鼠体内肿瘤并测量其体重，我们发M98-vector组瘤体重量明显高于过表达组(P＜0.05)。通过对肿瘤生长曲线进行绘制，我们观察到M98-SDPR组肿瘤的增殖速度被显著阻抑(P＜0.01)。免疫组化和苏木精-伊红染色结果显示：在SDPR过表达组中细胞增殖标记物Ki-67表达降低，核碎裂增强。进一步分析瘤体成分发现，SDPR能上调P21，下调cyclinB1的mRNA水平。
5.CCK8结果分析显示，SDPR过表达后加强了紫杉醇(PTX)和5-FU对非小细胞肺癌细胞抑制作用(P＜0.05)。沉默SDPR则使这种作用降低(P＜0.05)。同时SDPR对顺铂在NSCLC细胞的作用不具有统计学意义。
6.Westernblot检测结果表明，在p53缺失的H1299细胞中，SDPR可以提高cyclinB1，降低p21和p-cdc2的蛋白水平。相反，在A549细胞中siRNA介导的SDPR沉默会增加cyclinB1，并降低p53，p21和p-cdc2的蛋白表达。
结论
SDPR可以通过启动子甲基化沉默，它是致敏肿瘤细胞重要的抑癌基因，也可能是肺癌诊断重要的甲基化标志物以及潜在的治疗靶点，为肺癌的诊治提供新的线索。