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目的由于每年的季节性流感和不定期的流感大流行,流感病毒感染对公众健康构成重大威胁,也造成了较大的经济负担。直到现在,每年季节性流感爆发依然造成300～500万例严重病例和30～60万人死亡。由于目前抗病毒药物的疗效不理想,预防流感感染最有效的方法是接种疫苗。现有的流感疫苗主要诱导对病毒表面血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）的抗体,而这些抗原容易漂移使病毒容易逃避这些抗体的作用,降低了疫苗接种的有效性。这些疫苗还存在容易出现与流行株错配,抗原易变异,不适合老人和儿童,保护效果不好等缺点。同时,流感疫苗需要根据当年流行的毒株重新配制、生产和接种也耗费了相当大的资源。因此,亟待开发具有更长时间和更广泛保护效果的通用流感疫苗。许多研究表明,M2e是通用流感疫苗的候选蛋白,它是基质蛋白2（M2）N端的23个氨基酸结构域,在所有的甲型流感病毒中保守性超过99%。然而由于M2e蛋白在病毒表面丰度低、分子量小,需要用不同的方式来提高其免疫原性,例如:蛋白疫苗佐剂、纳米颗粒等方式。肺炎链球菌溶血素（Ply）是肺炎链球菌主要毒力因子之一。ΔA146Ply（ΔPly）是Ply蛋白的减毒突变体,本课题组前期发现ΔPly是安全有效的肺炎链球菌疫苗候选蛋白并可以作为蛋白疫苗佐剂。流感病毒继发细菌感染是病人死亡的重要原因,而肺炎链球菌是主要感染病原体之一。因此,本课题拟表达rM2e-ΔPly融合蛋白,肌肉免疫小鼠后探索ΔPly是否可以增强M2e蛋白的免疫原性,并探索其对甲型流感病毒感染及其与肺炎链球菌共感染的保护效果。方法首先,将四段来自人、猪、家禽甲型流感病毒中M2e的一致序列串联在一起,构成rM2e序列。在大肠杆菌中表达并纯化出rM2e、rM2e-ΔPly、ΔPly蛋白,并去除蛋白中的脂多糖。以蛋白为抗原,流感病毒M2e单克隆抗体（14C2）为抗体,分别用ELISA和Western Blot法验证蛋白是否包含流感病毒M2e表位。分别将rM2e、ΔPly、rM2e-ΔPly、rM2e+ΔPly蛋白经肌肉免疫BALB/c小鼠,H＆E染色主要脏器和血清肝肾功检测证明蛋白的生物安全性。ELISA法检测血清中抗体效价和抗体亚型,以及脾细胞经蛋白刺激后IL-4、IL-10、IFN-γ、IL-17A的表达。同时用三种来源于H1N1、H3N2、H5N1病毒的M2e多肽为抗原,ELISA法检测血清抗体交叉反应。用PR8病毒感染BALB/c小鼠后观察其生存率和体重变化,感染第六天取肺组织,用q RT-PCR法检测肺部病毒载量,ELISA法检测肺组织IL-6、TNF-α表达量,H＆E染色肺组织损伤情况。被动免疫法验证抗体对BALB/c小鼠的保护效果。用rM2e-ΔPly蛋白免疫C57BL/6和BALB/c小鼠,PR8感染小鼠后,观察其生存率和体重变化,用q RT-PCR法检测肺部病毒载量,ELISA法检测肺组织IL-6、TNF-α表达量。ELISA法检测血清中抗体效价和亚型,被动免疫法验证BALB/c小鼠抗体对C57BL/6小鼠的保护效果。分别将rM2e、ΔPly、rM2e-ΔPly、rM2e+ΔPly蛋白经肌肉免疫BALB/c小鼠,建立流感病毒和肺炎链球菌共感染模型。观察其生存率和体重变化,用q RT-PCR法检测肺部病毒载量,血平板菌落计数法分析肺部和鼻腔灌洗液中细菌载量。结果1、成功表达了rM2e、ΔPly、rM2e-ΔPly蛋白,并验证了rM2e、rM2e-ΔPly蛋白包含流感病毒M2e表位。2、与单独rM2e相比,rM2e-ΔPly可以使BALB/c小鼠产生更高的血清Ig G抗体,主要以Ig G1、Ig G2a和Ig G2b为主。rM2e-ΔPly组的脾细胞因子IFN-γ和IL-17A显著高于其它组。3、rM2e-ΔPly诱导的血清可以识别来源于H1N1、H3N2、H5N1病毒的M2e多肽,被动免疫BALB/c小鼠后可降低肺部病毒载量。4、流感病毒感染BALB/c小鼠,rM2e-ΔPly组相比于PBS组和rM2e组小鼠生存率显著提高。rM2e-ΔPly相较于其他四个组肺部病毒载量更低。rM2e-ΔPly组相比于PBS组,小鼠肺部的IL-6和TNF-α水平更低,肺组织的炎症细胞浸润和组织损伤更轻。而免疫C57BL/6小鼠后,rM2e-ΔPly组相比于PBS组无保护效果。5、免疫rM2e-ΔPly后,BALB/c小鼠产生的rM2e特异性Ig G比C57BL/6小鼠高10倍,而ΔPly特异性Ig G抗体无差异。抗体亚型检测显示,相比于C57BL/6小鼠,BALB/c小鼠诱导的Ig G1、Ig G2a更强,而Ig G2b无明显差异。6、甲型流感病毒和肺炎链球菌共感染模型,rM2e-ΔPly和ΔPly蛋白可提高BALB/c的生存率。在细菌感染后24h,rM2e、ΔPly、rM2e-ΔPly、rM2e+ΔPly均可以减轻小鼠肺部病毒载量,而肺部和鼻腔灌洗液中的细菌载量无明显差异。7、蛋白免疫BALB/c小鼠,rM2e、ΔPly、rM2e-ΔPly、rM2e+ΔPly组相比于PBS组小鼠体重变化、ALT、AST、Urea无明显差异,主要器官H＆E染色无明显病理学改变。结论本课题证明了ΔPly可作为M2e蛋白的佐剂,提高M2e蛋白的免疫原性,且无明显毒副作用。免疫rM2e-ΔPly可增强BALB/c小鼠的抗体生成和Th1、Th7细胞免疫反应,提高感染流感病毒BALB/c小鼠的生存率,减轻肺部病毒载量和炎症反应。rM2e-ΔPly蛋白诱导的血清抗体可单独保护BALB/c小鼠抵抗流感病毒,并且间接证明了该抗体可保护多种不同亚型的流感病毒。同时rM2e-ΔPly蛋白诱导的免疫保护作用在BALB/c和C57BL/6小鼠中有差异,可能与其细胞免疫和体液免疫的差异相关。rM2e-ΔPly可提高BALB/c小鼠的流感病毒和肺炎链球菌共感染模型的生存率。综上所述,rM2e-ΔPly有作为通用流感疫苗的潜力,并对流感病毒继发肺炎链球菌感染有一定保护效果。