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乳腺癌是女性人群中发病率居首位的恶性肿瘤,全国肿瘤登记中心2015年年报显示中国女性乳腺癌年发病人数约24.9万,近10年来发病一直呈上升趋势。因此,寻找安全有效的抗乳腺癌药物具有十分重要的意义。本课题组前期从盐生植物北美海蓬子和盐角草中分离得到12个三萜皂苷和9个降三萜皂苷。海蓬子降三萜皂苷是一类结构新颖的化合物,具有少见的三萜皂苷元母核—30-降齐墩果烷型五环三萜。目前全世界发现的此类皂苷不到30个,对其药效药理的研究几乎处于空白。本论文首次综合应用动物水平、细胞水平和分子水平,采用凝胶迁移阻滞实验(EMSA)、免疫印迹、流式细胞仪等技术,系统研究海蓬子降三萜皂苷的抗肿瘤效果及其作用机理。首先,细胞毒筛选结果表明从海蓬子和盐角草中分离得到的21个皂苦中有8个对人乳腺癌细胞MCF7、人宫颈癌细胞Hela和人肝癌细胞HepG2具有较好的细胞毒作用,IC50在10-70 μ之间(24 h)。构效分析发现C3位葡萄糖醛酸酯化,尤其是丁基酯化,是这类三萜皂苷细胞毒作用的关键;C28羧基也是这类三萜皂苷细胞毒作用的必需基团;C23位为甲基时细胞毒作用优于醛基。选择有活性的两种新降三萜皂苷海蓬子皂苷甲和海蓬子皂苷乙进行深入的抗肿瘤活性研究。结果发现海蓬子皂苷甲和海蓬子皂苷乙能有效抑制多种肿瘤细胞增殖(包括人乳腺癌细胞MCF7、人宫颈癌细胞Hela、人肝癌细胞HepG2、人肺癌细胞A549、人白血病细胞HL-60、小鼠黑色素瘤细胞B16、人结肠癌细胞Lovo和人胶质瘤细胞LN229),其中对人乳腺癌细胞系MCF7细胞最为敏感,IC50分别为5.5μM和12.6μM(72h)。对于3种类型的乳腺癌细胞MCF7、MDA-MB-231和MDA-MB-468,海蓬子皂苷甲对MCF7细胞的增殖抑制效果明显优于MDA-MB-231和MDA-MB-468,而海蓬子皂苷乙对MDA-MB-231细胞效果最好,对MCF7效果其次,对MDA-MB-468也有一定的效果;海蓬子皂苷甲和海蓬子皂苷乙对MCF7细胞的增殖抑制效果具有明显的时间依赖性;光学显微镜观察海蓬子皂苷甲和海蓬子皂苷乙作用后MCF7细胞萎缩,贴壁性降低,细胞变圆;克隆集落实验表明海蓬子皂苷甲和皂苷乙均能抑制MCF7克隆形成;且海蓬子皂苷甲的肿瘤抑制效果优于海蓬子皂苷乙。选择海蓬子皂苷甲进行急性毒性实验和体内裸鼠移植瘤实验,结果表明海蓬子皂苷甲对人乳腺癌细胞裸鼠移植瘤的生长具有一定抑制作用,抑制率为54.57%。然后,本文探讨了海蓬子皂苷甲抗MCF7细胞增殖的机制,表明海蓬子皂苷甲能够使MCF7细胞膜上磷脂酰丝氨酸外翻,使细胞形成亚二倍体DNA,引起细胞内染色质的浓缩和聚集,激活caspase-9、caspase-7和PARP,诱导人乳腺癌细胞MCF-7产生凋亡。分子机制研究发现海蓬子皂苷甲可以抑制MCF7细胞中IKK和IκBα磷酸化,从而使IκBα不能被泛素化蛋白酶体降解,将NF-κB固定在细胞质而不能进入细胞核;海蓬子皂苷甲能抑制p65蛋白表达、磷酸化以及转位入核,还能直接影响转录因子NF-κB与靶基因结合,抑制下游靶基因表达。NF-κB作为转录因子,可以调控多个凋亡相关因子,如Bc1-2、Bc1-x1和COX-2。随着海蓬子皂苷甲浓度增加,Bc1-2、Bc1-x1和COX-2蛋白表达均逐渐降低,从而使线粒体膜电位降低,诱导线粒体通路的细胞凋亡。最后,本文探讨了海蓬子皂苷甲调控细胞自噬的作用,表明海蓬子皂苷甲可以激活MCF7细胞产生酸性囊泡,增加LC3-II、Atg3和Atg16L1的表达,引起细胞自噬。分子机制的研究发现海蓬子皂苷甲可通过抑制Akt和p-ERK蛋白表达,从而抑制mTOR激活,下调mTOR下游分子p70S6K和4EBP1的磷酸化水平,诱导细胞自噬水平的提高,最终促进了人乳腺癌细胞MCF7存活。综上所述,海蓬子皂苷甲一方面通过抑制NF-κB的活性,降低抗凋亡基因Bc1-2、Bc1-x1和COX-2的表达,通过线粒体凋亡通路诱导细胞凋亡;另一方面,海蓬子皂苷甲可通过抑制Akt和p-ERK蛋白表达,从而抑制mTOR及其下游通路激活,诱导细胞自噬水平的提高,最终促进了人乳腺癌细胞MCF7存活。