由于β-内酰胺类抗生素（β-lactam antibiotics）广谱的抗菌作用，使得这类抗生素在临床上得到了广泛的应用。随着细菌耐药性的增强，人们发现改变这类抗生素的侧链可以使细菌对其的敏感性大大增强，耐药性也随之解除。半和成的β-内酰胺类抗生素工业引起了广泛的关注，青霉素类衍生物和头孢菌素类衍生物如苄青霉素（Benzylpenicillin）、阿莫西林（Amoxicillin）、福米西林（Formidacillin），头孢立新（Cephalexin）等的高效的杀菌作用使得β-内酰胺类抗生素仍然是世界上使用最广泛抗生素之一，传统的化学法合成正逐渐被酶法合成所代替，青霉素酰化酶（Penicillin Acylase， E.C.3.5.1.11）是半合成β－内酰胺类抗生素工业重要的工业用酶,主要是用于水解青霉素和头孢菌素生成母核6-APA（6-氨基青霉烷酸）和7-ADCA （7-氨基头孢烷酸）,以及催化6-APA和7-ADCA和不同侧链发应生成新的抗生素，一直是人们研究的重点。青霉素酰化酶可以分为三类：青霉素G酰化酶（PGA） 、青霉素V酰化酶（PVA）和氨苄青霉素酰化酶。PGA催化合成半合成β-内酰胺类抗生素是动力学控制反应平衡的过程，PGA是否能在半合成β-内酰胺类抗生素合成工业上得到应用，仅仅掌握PGA的水解活力或者合成活力都是不够的，而是要测定其合成和水解的比值，也就是PGA的S/H值。 本文主要研究内容包括：四种重组青霉素G酰化酶克隆、表达和快速纯化；建立用HPLC测定青霉素G酰化酶S/H的体系和十种青霉素G酰化酶的S/H值的测定。 <WP=69>目前已经有六种PGA的基因得到鉴定，它们分别是：来源于革兰氏阴性菌Esherichia coli（Ec）, Kluyvera citrophila（Kc）, Providencia rettgeri（Pr）, Alcaligenes faecalis（Afa）的青霉素G酰化酶和来源于革兰氏阳性菌 Bacillus megaterium（Bm）和Arthrobacter viscosus（Av）的青霉素G酰化酶，前四种青霉素G酰化酶的基因已经克隆到大肠杆菌中进行重组表达，为了进一步的研究青霉素G酰化酶的性质，人们分别纯化了四种PGA，但是由于这四种青霉素G酰化酶的性质各不相同，它们的纯化方法也有很大的区别，而且一般都需要两种填料柱才能得到纯的青霉素G酰化酶。为了能平行的比较各种定点突变和 DNA family shuffling得到的重组的青霉素G酰化酶的性质，需要建立一条能够适合各种青霉素酰化酶表达、纯化的路线。 本文主要研究了PGA在pET28b＋载体中表达，利用金属螯合层析载体Co2+-IDA agrose 一步纯化PGA（EcPGA、KcPGA、PrPGA、AfaPGA），一步纯化收率分别为36.3%、33.6%、19.7%、27.6%;纯化倍速分别为183、107、17、40。建立通用的表达、纯化不同来源的重组PGA的方法，这一方法主要的优点是：快速、简便、通用。Co2+-IDA agrose一步纯化表达产物PGA，并且纯化的条件无需有太大的变化，体现了快速和简便；根据以往的纯化PGA需要尝试不同的填料载体，本文介绍的用金属螯合层析填料适合纯化C端带有His-tag的PGA ，体现了这种方法的通用性。青霉素G酰化酶 S/H值的高低直接影响其在半合成β-内酰胺类抗生素工业上的应用，建立HPLC测定青霉素G酰化酶S/H的体系，将重组的青霉素G酰化酶进行S/H的测定，筛选出其中的S/H值高的青霉素G酰化酶。筛选得到的青霉素G酰化酶可以应用于抗生素的 <WP=70>合成工业。而青霉素G酰化酶的合成和水解反应是一个动态平衡的过程，对于头孢立新的合成来讲，反应体系主要由苯甘酰胺、7－ADCA、头孢立新和苯甘氨酸组成。要对这个反应中四种组分进行定时定量的研究,因此建立了用HPLC测定青霉素G酰化酶S/H的体系。首先在配制反应体系中四种物质标准品溶液并测定保留时间，经过HPLC分析后得到峰面积（As）对应标准品摩尔数（C*V1），得到系数K指单位峰面积物质的量。四种物质的系数分别定义为K1，K2，K3，K4（K1指苯甘氨酸的系数，K2指7－ADCA的系数，K3指头孢立新的系数，K4指苯甘酰氨胺的系数）。其次将待测的青霉素G酰化酶加入反应体系，间隔时间段取样检测，得到每种物质在不同时间的峰面积（Asn），则反应物在不同时间的摩尔数确定，绘制摩尔数与时间的曲线，根据青霉素G酰化酶S/H的定义，在母核7－ADCA与时间的曲线上找到消耗掉10％7-ADCA对应的时刻T，然后在头孢立新和苯甘氨酸对应时间的曲线上找到T时刻反应体系里生成头孢立新和苯甘氨酸的摩尔数Xn和Xn’,计算加入反应体系的青霉素G酰化酶的合成和水解比(S/H)，即为Xn和Xn’的比值。最后得到四种标准物质的系数为K1＝1.283*10-9、K2＝1.822*10-9、K3＝8.212*10-10、K4＝1.487*10-9,并测定了十种PGA的S/H值， wide type=4.12,β24F＝8.12,α144R＝5.22,145Y=0.78,A=4.02,B=15.08,KcPGA=14.98,EcPGA=11.0,PrPGA=10.08,AfaPGA=3.03.。