奶牛乳腺炎主要是由病原菌引起的一种炎症反应,大肠杆菌是导致乳腺炎发生的常见细菌之一。嗜中性粒细胞是炎症反应的第一效应者,可抵御病原菌侵袭。细菌侵入乳腺后,嗜中性粒细胞被招募且快速迁移至炎症部位吞噬细菌清除病原。DNA甲基化在炎症的发生、发展过程中发挥调控作用,并且与疾病易感性密切相关。鉴于此,本研究以半同胞健康和大肠杆菌乳腺炎奶牛为模型,进行如下研究:对血液嗜中性粒细胞进行DNA甲基化和RNA-seq测序;整合转录组和甲基化数据,筛选与炎症、免疫和防御反应相关的基因;通过亚硫酸盐测序和实时荧光定量PCR验证基因甲基化和表达水平,鉴定调控基因表达的甲基化位点,挖掘出与奶牛乳腺炎症反应相关的表观遗传学标记,揭示DNA甲基化在乳腺炎感染过程中发挥作用的分子机制,为奶牛乳腺炎的分子育种和治疗提供新证据。主要研究结果如下:(1)根据体细胞数测定、血液学分析和细菌学鉴定等实验筛选6头半同胞配对的健康奶牛(HC组,n=3)和大肠杆菌感染的乳腺炎奶牛(MC组,n=3)作为实验奶牛。采用简化甲基化测序技术分析了血液嗜中性粒细胞全基因组甲基化模式,绘制了染色体范围的全基因组甲基化图谱。鉴定出两组样品中的基因差异甲基化区域(DMRs),共检测到494个差异甲基化区域,其中61个DMRs高甲基化,433个DMRs低甲基化,表明在大肠杆菌感染后,奶牛血液嗜中性粒细胞DNA甲基化水平降低。在这些DMRs中,位于基因启动子、外显子和内含子区域的分别有75、75和344个;69个差异甲基化基因位于临床乳腺炎、体细胞计数和体细胞评分数量性状遗传位点区域内;同时在健康和乳腺炎组中鉴定出26个差异甲基化的miRNA。(2)利用转录组测序技术,对上述健康和大肠杆菌乳腺炎奶牛血液嗜中性粒细胞进行了基因表达分析,共检测到1339个差异表达基因,其中1094个基因上调表达,245个基因下调表达(MC vs HC),说明在大肠杆菌感染后,奶牛血液嗜中性粒细胞基因表达水平升高,其中415个差异表达基因位于临床乳腺炎、体细胞计数和体细胞评分QTL区域内,829个基因存在可变剪接现象。GO分析显示,差异表达基因中富集到免疫、炎症和防御反应的基因140个。(3)对甲基化和转录组数据进行相关性分析,鉴定出两组数据中共有基因29个,其中7个基因启动子区甲基化和表达水平负相关,11个基因外显子区域存在差异甲基化。应用软件预测了差异甲基化miRNA的潜在靶基因,与转录组中差异表达基因比对,在转录组数据中捕获到84个靶基因。(4)根据上述分析,筛选出CITED2、SLC40A1、LGR4、NCF4基因和bta-miR-15a进一步实验验证。利用亚硫酸盐测序对CITED2和SLC40A1基因启动子的甲基化进行分析,两组甲基化率显著不同,健康组CITED2和SLC40A1基因甲基化水平显著高于乳腺炎组,表达水平健康组显著低于乳腺炎组,表明CITED2和SLC40A1基因启动子的甲基化影响基因的差异表达,从而在大肠杆菌乳腺炎感染过程中发挥重要作用。在LGR4基因外显子5区域发现存在可变3’剪接体LGR4-TV,LGR4-reference和LGR4-TV在健康牛中的表达水平显著高于乳腺炎牛,LGR4基因甲基化水平和相对外显子包含水平均在健康牛与乳腺炎牛中存在差异,表明LGR4基因外显子5的甲基化调控基因外显子5的可变剪接。发现bta-miR-15a启动子甲基化水平健康组显著高于乳腺炎组,表达水平健康组显著低于乳腺炎组,对bta-miR-15a靶基因CD163进行了实验鉴定。定量表达实验表明靶基因CD163表达水平健康组显著高于乳腺炎组,说明bta-miR-15a启动子区的甲基化影响bta-miR-15a的差异表达,间接引起靶基因CD163表达水平产生差异,从而在大肠杆菌乳腺炎中发挥调控作用。(5)本研究还对差异表达基因NCF4在健康牛和乳腺炎牛血液嗜中性粒细胞中的启动子甲基化和表达水平进行了验证,并鉴定了NCF4基因3’UTR中的SNP g.18475 A>G,通过双荧光素酶活性测定,以及不同基因型与奶牛体细胞评分关联分析等实验,表明此SNP可能通过影响NCF4基因和bta-miR-2426的结合力调控NCF4基因的表达,从而导致奶牛乳腺炎抗性性状的差异。综上,本实验研究了大肠杆菌乳腺炎牛血液嗜中性粒细胞DNA甲基化和基因表达模式变化,分析了位于基因不同区域的DNA甲基化位点调控基因表达的分子机制,挖掘出在大肠杆菌乳腺炎中发挥作用的关键基因,为奶牛大肠杆菌乳腺炎的表观遗传标记研究及应用提供了理论依据。