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研究目的性激素及其受体与肿瘤发生、发展的研究一直是肿瘤研究者关注的热点,尤其在乳腺癌中,雌激素的促癌作用已被众多研究所证实,而对孕激素及其受体在乳腺癌发生、发展中的认识大多基于与雌激素相关联的研究,直接从孕激素及其受体角度进行研究将更有益于拓展乳腺癌靶向治疗的新方向。孕激素受体介导孕激素在乳腺癌发生、发展中作用的研究虽取得了一定的进展,但目前观点并不完全一致。不同的孕激素受体表达状态可介导孕激素对乳腺癌的生物特性呈现不同的影响。近年来新发现的孕激素膜受体α (Membrane Progesterone Receptor Alpha, mPRα)可介导孕激素的快速非基因组作用,与孕激素核受体的作用方式不同,备受肿瘤研究者的关注。目前,mPRα的研究主要集中在鱼类和两栖类的基础研究,在恶性肿瘤中,特别是在乳腺癌中的研究刚刚起步,在非性激素靶器官肺癌中尚无相关研究报道。肿瘤转移是肿瘤患者死亡的主要原因,上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal Transition, EMT)是肿瘤细胞侵袭转移的重要机制。我们前期研究发现mPRα可介导孕酮(Progesterone, P4)逆转乳腺癌MDA-MB468(MB468)细胞的EMT过程,对于mPRα是否介导孕酮对乳腺癌的迁移、侵袭及转移产生影响,以及在肺腺癌细胞中是否发挥类似作用,目前尚无报道。本研究观察比较mPRα在乳腺癌MB231Br (MB231Brain-seeking)细胞和MDA-MB231(MB231)细胞以及肺腺癌A549细胞和H1299细胞中的表达差异及定位,探讨mPRα对乳腺癌和肺腺癌细胞迁移侵袭能力的影响及其分子通路机制,分析乳腺癌组织mPRα表达及其与患者临床病理特征之间的关系。第一章mPRα在乳腺癌和肺腺癌细胞系的表达及其定位研究方法：1)利用RT-PCR和Western blot技术检测乳腺癌及肺腺癌细胞中mPRα mRNA和蛋白的表达。2)将不能透过细胞膜的异硫氰酸荧光素标记的牛血清白蛋白-孕酮复合物(Progesterone-BSA Conjugate Labeled with Fluorescein Isothiocyanate, P4-BSA-FITC)与细胞共培养,通过共聚焦显微镜观察mPRα在乳腺癌及肺腺癌细胞上的定位。结果：1)以MB231细胞作为mPRα表达的阴性对照,MB468细胞和稳定转染mPRα cDNA的MB231(MB231w/mPRα)细胞作为mPRα表达的阳性对照,乳腺癌MB231Br细胞中mPRα mRNA和蛋白呈中等强度表达,肺腺癌A549细胞mPRα mRNA和蛋白表达阳性,H1299细胞中表达阴性。2)在乳腺癌MB231Br细胞、MB231w/mPRα细胞和肺腺癌A549细胞的细胞膜上可见P4-BSA-FITC结合后发出的绿色荧光信号,而胞质和核内未见荧光信号。在MB231细胞和H1299细胞的细胞膜、胞质和核内均未见荧光信号。在MB231Br细胞和A549细胞的培养基中加入过量的游离孕酮后,细胞膜上原有荧光信号消失。结论：本研究首次发现乳腺癌脑转移MB231Br细胞中mPRα由母代MB231细胞无表达变为阳性表达,肺腺癌A549细胞中mPRα表达阳性,H1299细胞表达阴性；且mPRα定位于细胞膜,并能与孕酮特异性结合,提示mPRa可能特异性介导孕酮发挥重要作用。第二章mPRa介导孕酮对乳腺癌和肺腺癌细胞迁移和侵袭影响及其机制研究方法：1)使用孕酮(30ng/ml或60ng/ml)处理MB231Br和MB231细胞24或48小时,MTT法检测细胞增殖的改变。使用孕酮(0,15ng/ml,30ng/ml,60ng/ml)处理细胞48小时,显微镜观察细胞形态的改变。2)使用孕酮(30ng/ml)和/或Src抑制剂PP1(10μM),搭配特异性mPRa抗体、mPRa抗体的特异性结合封闭肽、孕激素核受体抑制剂米非司酮、PGRMC1抗体等不同组合处理乳腺癌和肺腺癌细胞16小时,利用细胞划痕实验观察细胞迁移能力的改变。3)使用孕酮(30ng/ml)和/或PP1(10μM)处理乳腺癌和肺腺癌细胞16小时,利用Transwell侵袭小室实验评价细胞侵袭能力。4)使用孕酮(30ng/ml)和／或PP1(10μM)处理乳腺癌和肺腺癌细胞16小时,利用Western blot技术检测FAK磷酸化活化蛋白(p-FAK)、MMP-9蛋白和KCNMA1蛋白的表达改变。结果：1)孕酮30ng/ml作用24小时可抑制MB231Br细胞和A549细胞的增殖,但与对照组相比未达到统计学差异。随着孕酮作用浓度和／或时间的延长,如孕酮30ng/ml作用48小时,以及孕酮60ng/ml作用24及48小时均可对MB231Br细胞和A549细胞的增殖产生明显抑制。MB231Br细胞的形态由典型的大小不等的纺锤形和狭长型间质细胞的形态,转变到多边形或卵圆形上皮细胞的形态。孕酮处理对MB231细胞和H1299细胞的增殖和形态均无明显影响。2)P4+PPl联合处理可明显抑制mPRα阳性乳腺癌MB231Br、 MB231w/mPRα细胞和MB468细胞以及肺腺癌A549细胞迁移,对mPRα阴性乳腺癌MB231细胞和肺腺癌H1299细胞没有影响。特异性mPRα抗体可封闭P4+PP1联合组对MB231Br细胞和A549细胞的迁移抑制作用,再加入mPRα抗体的特异性结合封闭肽,P4+PPl联合组中对肿瘤细胞的迁移抑制又恢复。提前加入米非司酮以及PGRMC1抗体处理对MB231Br细胞和A549细胞的迁移无明显影响。3)P4或／和PP1处理可抑制mPRα阳性乳腺癌MB231Br细胞和肺腺癌A549细胞的侵袭,P4+PP1联合处理使抑制作用明显增强；对mPRα阴性乳腺癌MB231细胞和肺腺癌H1299细胞没有影响。4)P4+PP1联合处理可显著降低MB231Br细胞和A549细胞中p-FAK蛋白、MMP-9和KCNMA1蛋白的表达,对MB231细胞和H1299细胞无明显影响。结论：1)本研究首次发现mPRα介导孕酮或／和PPl对乳腺癌MB231Br细胞迁移和侵袭发挥抑制作用。2)mPRα介导孕酮或／和PP1对肺腺癌A549细胞迁移和侵袭同样具有抑制作用。3) mPRα介导的上述作用可能是通过降低Src/FAK通路蛋白磷酸化活化,抑制MMP-9蛋白和KCNMA1蛋白表达的分子机制而实现的。第三章mPRα与乳腺癌组织临床病理特征的关系方法：利用乳腺癌组织芯片和免疫组化技术,检测mPRα在乳腺癌组织和癌旁良性乳腺组织中的表达,并分析其表达与ER、PR和HER-2及患者年龄、肿瘤病理分级、TNM分期、淋巴结转移和肿瘤分期等临床病理特征的关系。结果：1) mPRα的免疫组化染色强度得分在乳腺癌TNM4期组织显著低于TNM1-3期。mPRα高表达率及免疫组化染色强度得分与乳腺癌患者临床病理特征,如年龄、肿瘤病理分级及淋巴结转移无明显关联。2)ER阴性相比ER阳性的乳腺癌组织有较高的mPRα高表达率。mPRα高表达率及免疫组化染色强度得分与PR及HER-2表达均无明显关联。3) mPRα在HER-2+亚型(HER-2+, ER-, PR-)表达显著高于ER+亚型的乳腺癌组织。结论：mPRα表达与乳腺癌TNM分期及ER表达呈负相关,在HER-2+亚型显著高于ER+亚型乳腺癌组织。提示mPRα可能成为继ER, PR和HER-2之后新型乳腺癌分子生物标记。论文总结论1)首次发现乳腺癌脑转移MB231Br细胞中mPRα由母代MB231细胞无表达变为阳性表达,肺腺癌A549细胞中mPRα表达阳性,H1299细胞表达阴性；且mPRα定位于细胞膜,并能与孕酮特异性结合,提示mPRα可能特异性介导孕酮发挥重要作用。2) mPRα介导孕酮或／和PP1对乳腺癌MB231Br细胞和肺腺癌A549细胞迁移和侵袭发挥抑制作用,目前国内外尚无类似报道；这种抑制作用独立于孕激素核受体(Nuclear Progesterone Receptor, nPR)存在,可能是通过降低Src/FAK通路蛋白磷酸化活化,抑制MMP-9蛋白和KCNMA1蛋白表达的分子机制而实现。3)mPRα表达与乳腺癌TNM分期及ER表达呈负相关,在HER-2+亚型表达显著高于ER+亚型,提示mPRα有可能作为乳腺癌预后的分子生物标记。