论文部分内容阅读
基于细菌外膜囊泡(OMV)的天然免疫原性,卵清白蛋白(OVA)作为一种常用的模型抗原蛋白,PLGA生物相容性和可降解性好。本课题构建了 OMV包被的载OVA纳米粒(NP)给药系统,并用于小鼠鼻粘膜免疫的研究,为构建新型的鼻粘膜疫苗传递系统奠定基础。选用大肠杆菌DH5α为模型菌株,超滤浓缩法制备该菌OMV。通过透射电镜(TEM)观察OMV的形态,SDS-PAGE分析蛋白组分,Bradford、BCA分析方法测量蛋白浓度,鲎试剂(LAL)分析内毒素量。结果表明,超滤浓缩法制备的OMV为球形囊泡且无鞭毛、细胞碎片等杂质,粒径为152.3±1.8 nm,Zeta电位为-28.5±2.19 mV。OMV提取液的蛋白浓度为2.46mg/mL,内毒素量为5.7×103EU/mg。采用纳米沉淀法制备PLGANP,机械挤出法制备OMV包被PLGANP(OMV-PLGA NP)。以粒径和Zeta电位为评价指标,优化OMV-PLGANP制备条件。通过TEM表征形态,SDS-PAGE分析各蛋白表达,LAL测定内毒素含量,考察纳米粒长期稳定性和血清稳定性。选用OVA为模型蛋白,乳化溶剂挥发法制备载OVA的PLGA纳米粒(OVA@PLGA NP),采用单因素法优化OVA@PLGA NP制备条件。机械挤出法制备OVA@OMV-PLGANP。结果表明,OMV-PLGANP形态为壳核结构,其Zeta电位、蛋白表达及内毒素含量与OMV相近。在磷酸缓冲盐(PBS)或胎牛血清(FBS)两种介质中OMV-PLGA NP稳定性要明显强于PLGA NP和OMV。OVA@PLGA NP粒径为311.6±1.62 nm,Zeta 电势为-20.4±2.04 mV,载药率为 5.2%,TEM 观察表明OVA@OMV-PLGANP为壳核结构。OMV包被的载药纳米粒通过Balb/c小鼠鼻腔给药(OVA剂量25μg/只,OMV剂量15μg/只),给药7天和14天后,用ELISA法酶联检测小鼠血液中IgG抗体滴度或鼻腔灌洗液、空肠、粪便中特异性sIgA抗体滴度。结果表明,给药7天时,与OVA、OVA@PLGANP、OMV、OMV-PLGANP、OMV+OVA、OMV+OVA@PLGANP 给药组相比,OVA@OMV-PLGA NP给药组小鼠血液中IgG抗体滴度最高;给药14天时,OVA@OMV-PLGANP给药组在鼻腔灌洗液、空肠及粪便中OMV-sIgA、OVA-sIgA抗体滴度最高;与OMV+OVA给药组相比,OVA@OMV-PLGA NP给药组在鼻腔灌洗液、空肠粘膜及粪便中,OVA-sIgA抗体滴度分别提高了 1.6倍、2.1倍和1.7倍,而OMV-sIgA抗体滴度均提高了 1.5倍;与OMV+OVA@PLGANP给药组相比,OVA@OMV-PLGANP组OMV-sIgA抗体滴度分别提高了 1.2倍,1.1倍和1.1倍,说明OMV-PLGANP载体能同时使OMV和OVA被摄取与呈递,产生最强的免疫诱导反应