阳离子型非病毒基因载体具有免疫反应低、安全性能高、易于合成等特点，成为目前研究的热点。壳聚糖(CS)是一种天然阳离子聚合物多糖，由于其具有良好的生物安全性、可降解吸收性、组织黏附性、低的基因免疫性、合适的负载及转染效率，且对细胞几乎没有毒性，作为药物缓释和基因载体材料目前已引起广泛关注。CS分子链中有大量的氨基，通过静电作用可以与质粒DNA(或siRNA)复合形成CS/DNA复合粒子，从而有效地保护DNA不被脱氧核糖核酸酶(DNaseI)酶解，并安全进入细胞。但是高分子量的CS只溶解于稀酸，直接采用CS与DNA复合时需在酸性介质中进行，这对DNA的活性很木利。而且，CS难溶于一般性的有机溶剂也给其化学改性的有效实施及结构的控制带来很大困难。因此，寻找合适的途径使得CS在作为基因载体时能溶于生理环境，或者设计有效的合成路线对CS进行化学修饰，使其更好的应用于基因的负载和转染，一直是学者们努力的方向。除此之外，CS及其衍生物作为基因载体仍然存在转染效率低下等障碍，如何提高它的转染效率也是目前有待解决的一个难点。 基于以上考虑，本论文从三个方面对CS更好地作为药物或基因载体进行了改性及应用研究： (1)CS修饰聚乳酸.乙醇酸(PLGA)的阳离子型纳米微球。 采用乳化-溶剂挥发的方法，以不同分子量的CS(M<,w>=9×10<3>～37.2×10<4>)作为表面活性剂通过氢键作用涂覆在PLGA纳米微球表面，制备了可在生理盐水中与质粒DNA复合的阳离子PLGA/CS纳米微球。通过正交试验优化了纳米微球的工艺参数，考察了这些参数如PLGA和CS溶液浓度(C<,PLGA>，C<,CS>)、有机相/水相体积比(V<,o>V<,a>)、CS分子量、溶液pH值以及乳化方式对纳米微球粒径、表面电位及稳定性的影响。结果表明，采用本技术制备粒径较小而表面电位较高的阳离子型PLGA/CS纳米微球的最佳条件为：C<,CS>为3 mg/mL，C<,PLGA>为10 mg/mL，V<,o>V<,a>为1/4。制备的阳离子型PLGA/CS纳米粒子粒径在150～200 nm范围内，微球形状规整，荧光显微观察和XPS分析结果证实CS包覆于微球表面。在pH=4时，纳米粒子的表面电位达55 mV，在pH=7时纳米微球表面仍带正电，当pH=8时，表面电位转变为负值。以这种阳离子型PLGA/CS纳米微球为载体在生理介质中与质粒DNA复合，研究了它的负载效果和在293FT细胞中的转染效率。琼脂凝胶电泳显示，当PLGA/CS：DNA(w/w)为10：1时，PLGA/CS能有效地凝聚DNA，PLGA/CS/DNA复合物对293FT细胞的转染效率高于裸DNA，但低于Lipofectamine2000。因此，这种阳离子型纳米微球是一种可在温和条件下絮凝基因的载体材料。 (2)聚己内酯(PCL)接枝修饰CS。 由于CS分子内和分子间存在强烈的氢键作用，使得它难于溶解于一般的有机溶剂或去离子水，因此，CS的化学修饰在实施及对最终产物的结构控制均存在很大困难。论文以在有机溶剂中具有良好溶解性能的O-三苯甲基-CS为前驱体，与含端羧基的PCL-COOH通过NHS/DCC化学键合，在温和条件和均相体系中发生接枝反应。控制CS和PCL的摩尔投料比以及PCL分子链的长度，得到了系列不同CS取代度(ds)和不同侧链长度(M<,n>=1200～11000)的新型两亲梳状接枝共聚物CS-g-PCL。 采用<1>H NMR、<13>C NMR、IR、元素分析及GPC对反应过程中的中间产物及最终接枝共聚物结构进行了确证，<1>H NMR计算100个糖单元中CS的ds在0.28～0.49范围内。DSC结果显示，CS-g-PCL中PCL链段的熔融峰温(Tm)和熔融热焓(ΔH)均随着ds的增大和PCL链段的长度增加而增大，但都低于PCL均聚物；而且共聚物CS-g-PCL的DSC曲线存在两个熔融峰。说明接枝共聚物中PCL链段的结晶行为在一定程度上受到CS主链的干扰，导致PCL结晶相不完善。 X-衍射进一步证明，CS接枝PCL后，CS的结晶相被完全摧毁，新的PCL结晶区域出现，相应结晶峰的强度随ds升高而增大。与文献所报道的CS接枝聚酯完全不同的是，实验中所得到的系列CS-g-PCL共聚物溶解性能得到明显改善。当ds较高或PCL链段的分子量较大时，CS-g-PCL共聚物可溶于三氯甲烷；而当PCL链段分子量较低，ds适当的共聚物可完全溶于水介质；所有的CS-g-PCL共聚物均可通过溶解．水中透析的方法自组装形成以PCL链段为核、CS链段为壳、粒径为100～200 nm的纳米胶束。胶束的粒径随ds增加、PCL链段的分子量增大而增大，与之相反，胶束所带电位却降低。这与CS-g-PCL梳状共聚物在水相中组装形成多个疏水微区，疏水的PCL链段相互缠结，对CS的正电性产生屏蔽效应有关。 对CS-g-PCL共聚物的的生物相容性，以及CS-g-PCL纳米胶束对siRNA的复合和转染效率进行了研究。结果显示，CS-g-PCL纳米胶束与羊间充质干细胞(BMSCs)具有良好的生物相容性，并可有效地负载siRNA，对人成纤维细胞具有一定的基因转染效率。 上述研究结果提示，这种主链为亲水性的CS链段、侧链为疏水性的。PCL链段的新型接枝聚合物，在同时进行药物负载(内核负载输水性药物)和链接靶向配体或凝聚基因(CS外壳)方面具有双功能潜能，同时，也可作为一种新型的阳离子型组织工程支架。 (3)聚乙烯亚胺(PEI)修饰CS。 针对上述CS及其衍生物纳米粒子作为基因载体时存在转染效率低下等问题，论文设计以低分子量的PEI600和PEG2000修饰CS，希望获得一种高的基因转染效率、低的细胞毒性并具有可降解特性的阳离子型聚合物，利用阳离子聚合物分子本身的正电性直接与基因复合形成纳米粒子，提高它的负载效率和转染效率。 首先合成出PEI-b-mPEG两嵌段共聚物，然后采用高碘酸盐(10<,4><->)氧化CS形成相邻的双醛基，利用PEI-6-mPEG中的氨基与CS分子链中的醛基通过亚胺反应合成出三元梳状CS-g-(PEI-b-mPEG)共聚物。由于采用小分子量PE[接枝CS，既避免了高分子量PEI的阳离子毒性，又获得了高分子量PEI的转染效率，同时，小分子量的PEI可以随CS的降解而被代谢。mPEG的引入，对于提高纳米粒子的稳定性，屏蔽PEI对细胞膜的阳离子毒性也有重要的价值。 <1>H NMR、IR结果确证了不同共聚物的组成和结构。结果显示，[O<,4><->在氧化CS形成双醛的同时，降低了CS的分子量，PEI-b-mPEG接枝率达10.4﹪。 通过MTT实验对CS-g-(PEI-b-mPEG)共聚物的细胞毒性作了评价，结果显示，与PEI相比，CS-g-(PEI-b-mPEG)的毒性明显降低，随着CS-g-(PEI-b-mPEG)浓度增大，共聚物对细胞的毒性稍有增大，但仍远远低于PEI。聚合物的浓度为1 mg/mL，细胞的存活率仍有70﹪，而PEI不到20﹪。 CS-g-(PEI-b-mPEG)具有优良的水溶性，在生理条件下通过静电作用与siRNA组装形成由阳离子聚合物链段和RNA组成的疏水内核和PEG链段作为外壳的纳米胶束。凝胶电泳实验显示，当N/P比为15：1时CS-g-(PEI-b-mPEG)能够完全复合siRNA。复合物粒径为192±12.9 m，粒径分布窄。 流式细胞仪测试结果显示CS-g-(PEI-b-mPEG)/siRNA复合物对人成纤维细胞的转染效率(65.9±5.3﹪)明显高于裸siRNA(2.0±0.2﹪)及PEI/sirNA(7.9±0.6﹪)，且与市售Lipofectamihe2000相当(71.2±5.7﹪)。而毒性却远低于低分子量的PEI。 因此，CS-g-(PEI-b-mPEG)是一种非常有潜力的新型阳离子非病毒基因载体材料。