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本论文包括两部分,第一部分是新铁蛋白克隆的构建,以及蛋白的表达和纯化。第二部分是对血吸虫的呕吐物进行了二维电泳的分析研究。与论文内容相适应,摘要也分成两个部分。
1.新铁蛋白H-5在E.coli.中的表达和纯化
铁是人体必需的微量元素。铁缺乏可能会导致缺铁性贫血。铁缺乏是全世界尤其是发展中国家所面临的最主要的公共卫生问题之一。全球大约有30%人口处于铁匮乏的亚营养不良状态。我国大约有20.1%居民患有贫血病。如何解决这一世界性公共卫生问题,是摆在全人类面前的一个重大而艰巨的任务。
铁蛋白是自然界中最重要的铁贮存蛋白。铁蛋白贮藏铁的能力非常强,每个铁蛋白分子能够容纳多至4500个铁原子。植物铁蛋白中的铁,生物利用效率很高,是人类饮食铁的主要来源。因此,通过基因工程途径来创造铁蛋白过量表达的遗传改良作物,提高这些作物可食部分生物有效性铁的含量,可能是解决全球性铁缺乏问题的最有效的策略之一。
我们的研究工作主要有以下几个方面:
ⅰ)从大豆幼苗中克隆了一个新的大豆种子铁蛋白基因SferH-5(GenBank登陆号:EF055891)。与原先报道的SferH-1相比,推演的氨基酸序列之间有10个氨基酸残基的不同,其中5个分布在非成熟区,5个分布在成熟区。分布在成熟区的5个残基没有涉及到与铁吸收和铁贮藏相关的保守残基。推测,SferH-5编码一个新的大豆种子铁蛋白26.5-kDa亚基,H-5。
ⅱ)构建了H-5/H-2复合物的原核表达载体,实现了其在大肠杆菌中的高效表达,并对其进行了纯化。
2.血吸虫呕吐物的二维电泳分析
血吸虫病是一种人兽共患的寄生虫病,在全世界范围内广泛分布,中国的某些地区疫情仍很严重。在防治过程中,人群再感染和控制地区血吸虫病的再度流行,一直是防治实践中的难题。血吸虫感染的实验诊断是寻找并确定血吸虫在体内存在的直接或间接的证据,为血吸虫感染的临床诊断和治疗提供依据。随着分子生物学和血吸虫免疫学的进步,人们对血吸虫感染的实验诊断方法的研究也进步迅速。
血吸虫病的实验诊断中,病原学诊断方法虽特异性强,但检出率低,难于检出低度感染患者。以可溶性虫卵抗原(SEA)或AWA建立的免疫学诊断方法虽然灵敏度高,但特异性不强,与其它寄生虫存在交叉反应。
寄生虫排泄分泌物是寄生虫的一种重要抗原,其中既有特异性的诊断抗原,也有调节宿主免疫应答的成分。血吸虫成虫肠道呕吐物代表血吸虫排泄分泌抗原,在宿主对血吸虫的免疫应答中同样具有重要作用。基于此,分析呕吐物的生化和免疫学特性,鉴定出其中的特异性免疫学活性分子,不仅有助于阐明宿主对血吸虫的免疫效应机制,而且可为血吸虫病诊断和疗效考核提供有用的抗原分子。
本文主要通过二维电泳技术对血吸虫成虫的呕吐物进行研究,找出不同时段下呕吐物中的蛋白差异,希望通过这样找到一种比较有效的考核疗效的抗原分子。