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猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的猪水样泄泻、脱水、呕吐为主要特征的病毒性肠道传染病。该病主要发生在冬春季,夏秋季节零星发病,各年龄段猪均易感,尤其危害哺乳仔猪,给我国养猪业的发展造成巨大损失。近年来我国PEDV流行株的变异造成了传统疫苗免疫效力的下降,导致各大养猪省份陆续爆发PED疫情,因此对其的有效防控已是当下需要迫切解决的问题,但目前我国缺乏有效检测病原的试剂盒,国内市场上仍没有商品化的PEDV抗体检测试剂盒,进口检测试剂盒价格昂贵,不适合在基层推广使用,故研发一种可靠的适用于大批量样本PEDV血清学检测的试剂盒,成为本试验的研究目的。PEDV的纤突蛋白S蛋白是病毒侵入时介导病毒进入宿主细胞的重要结构蛋白,可刺激细胞产生中和抗体,且S蛋白产生的抗体在疾病进程中存在较长时间,在病原检测和流行病学研究中具有重要意义。本研究以原核大肠杆菌系统表达的重组截短S蛋白为抗原,建立了检测PEDV抗体的ELISA方法,并将该ELISA方法应用到临床样品检测,为了解PED流行状况提供了可靠的技术支持。本研究内容如下:1.PEDV截短S蛋白的原核表达根据GenBank公布的PEDV CZ2014株S基因序列设计一对特异性引物,利用RT-PCR扩增出部分S基因,连接到大肠杆菌表达系统的亚克隆表达载体pET-28a,获得重组表达质粒28a-S1,将其转化至宿主菌BL21(DE3),通过IPTG诱导,SDS-PAGE鉴定得到重组蛋白S1,大小约40 KDa,以包涵体形式表达。重组蛋白纯化后经Western blotting鉴定表明其能与PEDV阳性血清结合,说明表达的重组蛋白反应原性良好。2.PEDV抗体间接ELISA检测方法的建立以纯化的重组S1蛋白包被ELISA板,建立了检测PEDV抗体的间接ELISA方法。优化的反应条件如下:抗原最佳包被浓度为7.5μg/mL,包被条件为37℃ 2 h;最适封闭液为含有5%脱脂乳的PBS;血清最佳稀释度为80倍,37℃作用30 min;酶标二抗最佳稀释度为1:10000,37℃作用1 h;TMB底物显色液最佳作用时间为20 min。由33份阴性血清测得ELISA方法阴阳临界值为0.286,且经测定该方法的批内重复平均值为3.31%,批间重复性均值为4.32%,检测猪瘟、猪传染性胃肠炎、猪轮状病毒、猪圆环病毒2型阳性血清均为阴性,说明本试验建立的间接ELISA方法具有较好的重复性和特异性。3.PEDV抗体间接ELISA检测方法的应用用进口 PEDV检测试剂盒同本研究建立的ELISA方法做比较,同时检测92份PEDV抗体效价不同的血清,总体符合率为86.96%,证明该ELISA方法敏感性和特异性良好。用已建立的间接ELISA方法检测从江苏南通正大集团、温氏集团各猪场采集的564份各年龄段猪血清PEDV抗体,试验结果显示PEDV总阳性率为61.17%,t同时猪群血清PEDV抗体阳性率随猪年龄段不同而相异,哺乳仔猪血清PEDV抗体阳性率为26.47%,保育猪、架子猪阳性率分别为36.67%、50%,育肥猪阳性率为31.93%,妊娠母猪、哺乳母猪和种猪因注射疫苗血清PEDV抗体水平很高,后备母猪的阳性率达到85.29%。试验结果表明PEDV抗体阳性率因猪年龄段、群体等不同而不同,哺乳仔猪和育肥猪阳性率较低,其他年龄段的猪阳性率相对较高。本试验用建立的ELISA方法进行了大样本量的PEDV血清学检测,为PEDV的检测和免疫抗体水平的监测等提供了重要参考。