L-叔亮氨酸（L-tert-leucine,L-tle）属于非蛋白原手性氨基酸,广泛应用于制药和食品行业,尤其是作为药物中间体在合成艾滋病毒蛋白抑制剂、抗癌、抗病毒药物等领域的应用。亮氨酸脱氢酶（LeuDH,EC 1.4.1.9）通过耦联葡萄糖脱氢酶（GDH,EC 1.1.1.47）进行辅酶循环再生,可以催化三甲基丙酮酸制备手性纯的L-叔亮氨酸。受自然界多酶复合体具有高效快速催化反应和结构稳定性的启发,多酶融合耦联体系可能是一种提高L-叔亮氨酸生产效率的理想方法。本论文构建了用于L-叔亮氨酸合成的亮氨酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶融合酶体系,对其催化性能和组装特性进行了研究,主要完成了以下实验:一、重组大肠杆菌的构建。以pUC18-leudh和pUC18-gdh为模板分别扩增编码LeuDH和GDH蛋白的基因片段;以PCR产物leudh和gdh为模板,插入刚性多肽R3的编码基因,通过重叠延伸PCR方法融合基因片段得到gdh-r3-leudh;融合基因与pET-28a质粒载体双酶切后,连接得到重组质粒pET-28a-leudh-r3-gdh,此外构建了重组质粒 pET-28a-leudh和pET-28a-gdh;将上述3种重组质粒分别转化大肠杆菌,得到3株相应的重组大肠杆菌。二、酶的诱导表达与酶学性质研究。将构建的3株重组大肠杆菌扩大培养诱导重组蛋白表达,分别获得融合酶LeuDH-R3-GDH与游离酶LeuDH和GDH,然后利用His-Trap HP亲和镍柱纯化,蛋白通过SDS-PAGE分析,最后测定各自的比酶活。分别考察上述获得的融合酶和游离酶的动力学参数、最适pH和温度及热稳定性发现:（1）融合的GDH和LeuDH的Km值比游离的GDH和LeuDH的高、融合的GDH和LeuDH的kcat和kcat/Km值比游离的GDH和LeuDH的低,结果表明双酶融合后底物与酶的亲和力以及催化效率均有所降低;（2）游离的GDH最适pH为8.0,而融合的GDH在pH 6.0～9.0范围内维持80%以上的酶活,游离的GDH和LeuDH的最适温度均为70℃,而融合的GDH和LeuDH的最适温度均为80℃,结果显示融合酶具有更好的pH和稳定耐受性;（3）随着环境温度提高,融合酶酶活逐渐下降,融合的GDH在50℃孵育3 h仍保持40%的酶活,而游离的GDH在0.5 h后几乎失活,结果表明融合酶具有更高的热稳定性,这可能与刚性多肽和融合结构提高复合体结构稳定性有关。三、融合酶的催化性能研究。考察了融合酶状态、辅酶浓度、底物浓度以及其他反应条件对融合酶催化制备L-叔亮氨酸的影响,优化并放大了融合酶制备L-叔亮氨酸的催化体系。最适催化反应条件为:融合酶采用全细胞形式、NAD+浓度为0.4mM,底物浓度为500mM,30℃,pH9.0;采取上述优化后的催化反应条件,放大催化体系至200 mL,使用干重含量40 g/L的融合酶全细胞催化500 mM底物,反应0.5 h,生产强度可达到最高的2135.9 g/L/d,对应的L-叔亮氨酸得率为67.85%,e.e.值均大于99%。四、融合酶活性包涵体的催化性能研究。实验发现融合酶在胞内过表达可形成大量活性包涵体,70%的重组蛋白和超过85%的GDH和LeuDH酶活均分布于活性包涵体,且其表现出优于游离融合酶的催化性能;融合酶活性包涵体具有较好的可重复利用性,在连续6次回收催化后产物浓度仍保留首次催化得率的90%以上;采用了底物补料的方式,20 mL融合酶活性包涵体催化体系反应6 h,L-叔亮氨酸浓度达37.1 g/L,放大至200 mL催化体系后,反应24 h最终合成L-叔亮氨酸的浓度可达48.4 g/L。五、融合酶的组装特性研究。从融合酶组装过程分析,随着IPTG诱导融合酶蛋白表达的时间推进,活性包涵体的蛋白和酶活占比均逐渐提高;胞外融合酶浓缩提高蛋白浓度后会生成沉淀,其上清和沉淀的蛋白和酶活分布情况与胞内活性包涵体的表达结果相似;动态光散射分析发现融合酶粒径与蛋白浓度呈正相关关系,结果表明蛋白浓度的提高可促进融合酶自组装形成不溶性聚集体。从融合酶组装形态分析,扫描电镜观测结果发现融合酶活性包涵体组装形成规则结构,纯酶浓缩后的不溶性聚集体的形貌结构与活性包涵体类似,甚至组装形成更为规则的片层结构;原子力显微镜分析不溶性聚集体,发现其形成了组装的多层片状结构。结合胞内与胞外融合酶的组装过程与组装形态分析,推测活性包涵体及不溶性聚集体均是融合酶在高浓度蛋白情况下,由寡聚作用力介导的自组装行为所形成的超分子多酶复合体结构。