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微藻可以利用光合作用将光能转换成化学能,化学能在微藻中的储存方式主要是淀粉、油脂等形式,储存性脂主要为三酰甘油(TAG)并以油滴的形式存在于细胞质中,而淀粉主要以淀粉体的形式存在于质体中。一般情况下微藻细胞不积累油脂,而在生存压力下,如在氮胁迫的环境下,细胞会产生大量的油滴。目前人们对微藻细胞内油脂代谢及其调控的认识还很浅显,迫切需要加强对油脂代谢和油滴的形成机制等问题的研究,并探索在物质代谢途径中这几种储能物质是如何相互转化的,为高产油微藻的选育提供理论依据。莱茵衣藻是一种单细胞的真核绿藻,且其遗传背景较清楚。以莱茵衣藻为模式生物,探索影响衣藻中油脂积累相关的基因,其取得的成果可以为工程微藻提高油脂含量的遗传改造提供理论依据。由于淀粉和油脂都是莱茵衣藻体内的储能物质,本研究我们对糖脂合成相关基因(SQD1、SQD2、MGDG)以及淀粉合成相关的基因(SSS2、STA6、AMYB1)这六个基因进行干扰,并探讨其在这淀粉合成途径和油脂合成途径中的作用。首先用一步法PCR分别构建了针对这六个基因的amiRNA供体载体,通过接合转移技术(MAGIC)分别构建了针对这六种基因的amiRNA表达载体,然后通过玻璃珠法分别将这六个amiRNA表达载体转化到莱茵衣藻CC-425细胞,然后对转基因衣藻进行干扰效果的分析。在高等油料作物中,二酰甘油(DAG)是合成TAG的直接前体;同时,DAG也是合成糖脂重要前体分子,如果能阻止DAG转化为糖脂,可能会促进TAG的合成。所以我们选择干扰由DAG合成糖脂的途径,观察其对TAG的合成产生影响。硫代异鼠李糖甘油二酯(SQDG)是一种含硫的糖脂,它由UDP-葡萄糖(UDP_GLC)与亚硫酸盐通过UDP-sμLfoquinovose合成酶(SQD1)催化形成UDP-硫代异鼠李糖(UDP_SQ)后与DAG由磺脂酸合成酶(SQD2)催化合成。单半乳糖二酰基甘油(MGDG)由UDP-半乳糖和DAG经由MGDG合成酶催化合成。SSS2、STA6、AMYB1基因都是淀粉合成途径中的关键酶,其中STA6是ADP-葡萄糖焦磷酸化酶的一个亚基,SSS2则是淀粉合成酶,AMYB1是淀粉水解酶。荧光定量PCR检测结果显示转基因衣藻中六个基因的相对转录水平都有所降低,其中C.reinharddtii(pmiR1162-SSS2)藻株中SSS2基因的mRNA表达量平均下降了 29%;C.reinharddti(pmiR1162-AMYBi)藻株中AMYB1基因的mRNA表达量平均下降了 45%;C.reinharddtii(pmiR1162-STA6)藻株中STA6基因的mRNA表达量下降平均下降了 41%;C.reinharddtii(pmiR11 62-SQD1)藻株中SQD1基因的mRNA表达量平均下降了 61%;C.reinh arddtii(pmiR1162-SQD2)藻株中SQD2基因的mRNA表达量平均下降了 48%;C.reinharddtii(pmiR1162-MGDG)藻株中MGDG基因的mRNA表达量下降平均下降了 39%,利用浓硫酸-蒽酮法测量藻株淀粉含量显示干扰糖脂合成相关基因后淀粉含量会随着缺N培养时间的延长而呈上升趋势,干扰淀粉合成的基因的藻株淀粉含量会随着缺N培养时间的延长而呈下降趋势:运用薄层层析法测量油脂含量数据表明干扰糖脂和淀粉合成基因的藻株油脂含量都有上升,并在缺N培养48h后达到最高,此时与野生型莱茵衣藻(CC425)相比C.reinharddtii(pmiR1162-SSS2)藻株油脂含量升高了 126%;C.reinhiarddt(pmiR1162-AMYB1)藻株油脂含量升高了 93.7%,C.reinharddtii(pmiR1162-ST4A6)藻株油脂含量升高了 89.9%;C.reinharddtii(pmiR1162-SQD1)藻株油脂含量上升了 101%;C.reinharddtii(pmiR1162-SQD2)藻株油脂含量上升了 152%,C.reinharddtii(pmiR1162-MGDG)藻株油脂含量上升了 167%。