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猪链球菌(Streptococcus suis，SS)作为危害严重的一种人兽共患病原体。能够感染猪引起各种炎性反应和高病死率，同时还可以引起人出现高比例的链球菌中毒性休克综合症( streptococcus toxicshock syndrome，STSS)。丙酮酸脱氢酶（Pyruvate dehydrogenase，PDH）是生物体内广泛存在的多酶复合体，负责催化丙酮酸氧化脱羧形成乙酰CoA（Acetyl-CoA），同时将NAD+还原为NADH，在能量代谢和循环中起关键作用。前期蛋白组学研究发现，S. suis菌株在生物被膜（Biofilm，BF）状态下PDH蛋白含量是浮游状态下的2.5倍左右。但是对于其是否参与S. suis其他功能方面未见报道。因此，本研究主要针对S. suis2型ZY05719菌株的pdh基因进行研究，以明确pdh基因的可能功能。LuxS/AI-2系统是在革兰阴性菌和革兰阳性菌中广泛分布的一种密度感应系统（Quorum sensing，QS），参与生理过程包含化学发光、抗生素产生、毒力因子表达和BF形成等。对于病原性细菌，认识和掌握LuxS/AI-2型 QS系统，进而打开新的抗菌思路具有重要意义。基于RNA-seq技术的转录组学分析，寻找自诱导信号分子AI-2下游调控基因，能够为全面系统分析S．suis的传播和致病机制提供重要依据。主要研究内容包括：
1.S. suis2型ZY05719pdh基因缺失株的构建和鉴定
使用自杀载体pSET4s通过等位基因交换在S．suis中敲除pdh。首先，通过PCR从ZY05719的基因组扩增两个侧翼于pdh基因的DNA片段，然后使用引物Tup/ Sdown通过融合PCR扩增不含pdh基因的同源重组片段。用SalI和EcoRI限制酶消化后，将同源重组片段克隆到载体 pSET4s 中以构建 pdh 敲除质粒pSET4s-pdh。为了获得同基因突变体△pdh，通过电穿孔将重组质粒 pSET4s-pdh转化到制备的ZY05719感受态细胞中。通过2次同源重组获得pdh基因缺失阳性菌株。使用侧向鉴定引物pdh-X /pdh-Y和内部鉴定引物pdh-ORF-S /pdh-ORF-A分析基因组DNA（gDNA），并对PCR产物进行DNA测序。确认pdh突变体的正确特征。同时利用大肠杆菌-猪链球菌穿梭质粒 pSET2s 构建 pdh 基因回补菌株CΔpdh。用S. suis2野生型菌株用作阴性对照。结果显示：本实验成功获得pdh基因缺失株（Δpdh）和pdh基因回补菌株CΔpdh。
2.PDH参与S. suis2型致病性分析
通过检测对比野生株、Δpdh株和CΔpdh株在生长曲线、半数致死量（LD50）、细菌感染小鼠后在体内的动态分布检测、条件应激反应（盐应激，氧应激，酸应激和热应激）、BF形成能力、粘附力、侵袭力以及粘附相关基因qPCR等数据方面
的差异，以及对小鼠毒力等方面进行检测。从而明确Δpdh株相关性状的变化。结果显示：pdh基因缺失将导致S. suis2在生长对数期滞后于野生株，但在相同时间点活菌数无显著差异性；野生株、Δpdh和CΔpdh株的LD50分别为2.245×105 CFU、3.874×106 CFU 和 1.062×105CFU；取小鼠血，脑，脾，肝，肾，肺后，分析小鼠各器官细菌的分布情况，Δpdh的细菌计数显著低于野生菌株；BF形成能力减弱；粘附能力和侵袭能力减弱；应激实验结果表明，Δpdh株对抗盐应激、氧应激和热应激的能力减弱，但抗酸应激能力与野生株相比，差异不显著。所有研究结果表明，PDH不仅参与碳水化合物的代谢，而且也参与了S. suis相关致病机制。
3.丙酮酸脱氢酶参与调控S. suis细胞分裂研究
S. suis细胞分裂过程是其生长和繁殖的一个组成部分，受复杂监管网络调控。在本研究中，通过沉降实验，发现S. suis中pdh基因的缺失导致细菌沉降速度加快；革兰染色和电镜实验结果表明细胞链增长，形态丰满和 Z 环的异常定位，表明敲除突变体的分裂能力受到适当削弱；同时，构建S. suis2型ZY05719株pdh和分裂相关蛋白ftsZ基因的原核表达载体，获得PDH蛋白和FtsZ蛋白。通过间接ELISA证实了FtsZ和PDH在体外相互作用；qPCR分析显示pdh基因的缺失导致分裂相关基因ftsZ，ftsK，fts1，zapA，divIC，bpb1a，rodA，mreD和sepF的差异表达。结果表明，在S. suis细胞分裂期间，pdh参与Z环的正常形成和细胞形态。4.通过RNA-seq技术初步分析AI-2对S. suis转录组的调控作用
LuxS/AI-2型 QS系统通过调整自然环境下细菌间信息交流因子，调控菌群生物学特性。利用RNA-seq技术获得参与S．suis对AI-2摄取的下游调控基因，即了解 AI-2 是通过 S．suis 哪些靶蛋白来调控 S．suis 的生物学特性？本实验采取RNA-Seq技术分析AI-2分子作用下S．suis 2 ZY05719基因表达水平变化，并利用荧光定量PCR方法验证相关表达差异基因。结果显示：添加AI-2培养8h条件野生菌株样本（AI-8）与未添加AI-2培养8h条件下的野生菌株样本（FY-8）相比，共有152个显著差异表达基因。实验结果证明，AI-2信号分子对S. suis2的生物过程、细胞组分和分子功能三大类别都有显著调控作用。显示在有机物质代谢过程中上调基因有37个，下调基因有30个；在主要代谢过程中上调基因有35个，下调基因有29个；在代谢过程中上调基因有42个，下调基因有32个；在细胞组分的周质空间、蛋白质-脂质复合物和血浆脂蛋白颗粒方面共有3个基因下调且这三个基因都指向SSU05_0721，该基因负责转录一种未知蛋白组，其中的BglG蛋白参与调控转录抗终止子；分子功能方面共有11个GO term，共有31个基因下调， 13 个基因上调，且相关差异表达基因集中在酶活性方面，说明酶活性总体呈下降趋势。
1.S. suis2型ZY05719pdh基因缺失株的构建和鉴定
使用自杀载体pSET4s通过等位基因交换在S．suis中敲除pdh。首先，通过PCR从ZY05719的基因组扩增两个侧翼于pdh基因的DNA片段，然后使用引物Tup/ Sdown通过融合PCR扩增不含pdh基因的同源重组片段。用SalI和EcoRI限制酶消化后，将同源重组片段克隆到载体 pSET4s 中以构建 pdh 敲除质粒pSET4s-pdh。为了获得同基因突变体△pdh，通过电穿孔将重组质粒 pSET4s-pdh转化到制备的ZY05719感受态细胞中。通过2次同源重组获得pdh基因缺失阳性菌株。使用侧向鉴定引物pdh-X /pdh-Y和内部鉴定引物pdh-ORF-S /pdh-ORF-A分析基因组DNA（gDNA），并对PCR产物进行DNA测序。确认pdh突变体的正确特征。同时利用大肠杆菌-猪链球菌穿梭质粒 pSET2s 构建 pdh 基因回补菌株CΔpdh。用S. suis2野生型菌株用作阴性对照。结果显示：本实验成功获得pdh基因缺失株（Δpdh）和pdh基因回补菌株CΔpdh。
2.PDH参与S. suis2型致病性分析
通过检测对比野生株、Δpdh株和CΔpdh株在生长曲线、半数致死量（LD50）、细菌感染小鼠后在体内的动态分布检测、条件应激反应（盐应激，氧应激，酸应激和热应激）、BF形成能力、粘附力、侵袭力以及粘附相关基因qPCR等数据方面
的差异，以及对小鼠毒力等方面进行检测。从而明确Δpdh株相关性状的变化。结果显示：pdh基因缺失将导致S. suis2在生长对数期滞后于野生株，但在相同时间点活菌数无显著差异性；野生株、Δpdh和CΔpdh株的LD50分别为2.245×105 CFU、3.874×106 CFU 和 1.062×105CFU；取小鼠血，脑，脾，肝，肾，肺后，分析小鼠各器官细菌的分布情况，Δpdh的细菌计数显著低于野生菌株；BF形成能力减弱；粘附能力和侵袭能力减弱；应激实验结果表明，Δpdh株对抗盐应激、氧应激和热应激的能力减弱，但抗酸应激能力与野生株相比，差异不显著。所有研究结果表明，PDH不仅参与碳水化合物的代谢，而且也参与了S. suis相关致病机制。
3.丙酮酸脱氢酶参与调控S. suis细胞分裂研究
S. suis细胞分裂过程是其生长和繁殖的一个组成部分，受复杂监管网络调控。在本研究中，通过沉降实验，发现S. suis中pdh基因的缺失导致细菌沉降速度加快；革兰染色和电镜实验结果表明细胞链增长，形态丰满和 Z 环的异常定位，表明敲除突变体的分裂能力受到适当削弱；同时，构建S. suis2型ZY05719株pdh和分裂相关蛋白ftsZ基因的原核表达载体，获得PDH蛋白和FtsZ蛋白。通过间接ELISA证实了FtsZ和PDH在体外相互作用；qPCR分析显示pdh基因的缺失导致分裂相关基因ftsZ，ftsK，fts1，zapA，divIC，bpb1a，rodA，mreD和sepF的差异表达。结果表明，在S. suis细胞分裂期间，pdh参与Z环的正常形成和细胞形态。4.通过RNA-seq技术初步分析AI-2对S. suis转录组的调控作用
LuxS/AI-2型 QS系统通过调整自然环境下细菌间信息交流因子，调控菌群生物学特性。利用RNA-seq技术获得参与S．suis对AI-2摄取的下游调控基因，即了解 AI-2 是通过 S．suis 哪些靶蛋白来调控 S．suis 的生物学特性？本实验采取RNA-Seq技术分析AI-2分子作用下S．suis 2 ZY05719基因表达水平变化，并利用荧光定量PCR方法验证相关表达差异基因。结果显示：添加AI-2培养8h条件野生菌株样本（AI-8）与未添加AI-2培养8h条件下的野生菌株样本（FY-8）相比，共有152个显著差异表达基因。实验结果证明，AI-2信号分子对S. suis2的生物过程、细胞组分和分子功能三大类别都有显著调控作用。显示在有机物质代谢过程中上调基因有37个，下调基因有30个；在主要代谢过程中上调基因有35个，下调基因有29个；在代谢过程中上调基因有42个，下调基因有32个；在细胞组分的周质空间、蛋白质-脂质复合物和血浆脂蛋白颗粒方面共有3个基因下调且这三个基因都指向SSU05_0721，该基因负责转录一种未知蛋白组，其中的BglG蛋白参与调控转录抗终止子；分子功能方面共有11个GO term，共有31个基因下调， 13 个基因上调，且相关差异表达基因集中在酶活性方面，说明酶活性总体呈下降趋势。