【摘 要】
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研究背景:近来研究表明依赖肠道微生物的胆碱代谢物氧化三甲胺（TMAO）与心血管疾病密切相关,TMAO可通过诱导炎症及应激反应促进心血管疾病发生发展。已知炎症和应激反应参与钙化性主动脉瓣疾病（CAVD）的进展。然而,TMAO在CAVD中的作用尚不清楚。目的:本研究通过病例样本收集、体外实验和小鼠在体实验,探索TMAO促进CAVD发生发展的机制,拟证明TMAO通过调节内质网（ER）-线粒体应激促进CA
【基金项目】
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国家自然科学基金面上项目,81770386,氧化三甲胺通过调节内质网-线粒体应激促进钙化性主动脉瓣疾病发生发展的机制研究； 广东省省级科技计划项目,2017A050501019,天然免疫受体介导钙化性主动脉瓣疾病发生发展的机制研究；
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研究背景:近来研究表明依赖肠道微生物的胆碱代谢物氧化三甲胺（TMAO）与心血管疾病密切相关,TMAO可通过诱导炎症及应激反应促进心血管疾病发生发展。已知炎症和应激反应参与钙化性主动脉瓣疾病（CAVD）的进展。然而,TMAO在CAVD中的作用尚不清楚。目的:本研究通过病例样本收集、体外实验和小鼠在体实验,探索TMAO促进CAVD发生发展的机制,拟证明TMAO通过调节内质网（ER）-线粒体应激促进CAVD的发生发展,为进一步认识CAVD提供崭新理论依据,也为防治该病提供新的辅助评估指标和干预靶点。方法:临床样本检测:收集钙化性主动脉瓣疾病及非钙化主动脉瓣疾病患者的血浆及基本资料,采用高效液相色谱串联质谱法（HPLC-MS/MS）测定TMAO水平并进行分析。细胞实验:（1）提取原代人主动脉瓣膜间质细胞（AVICs）,给予TMAO刺激,检测活性氧,线粒体膜电位等指标,通过免疫印迹实验检测ALP、BMP-2、ATF-4、XBP-1s、CHOP蛋白水平以及IRE-1α和NF-κB磷酸化水平,通过透射电子显微镜观察线粒体及内质网形态,通过茜素红染色检测钙化结节。（2）分别给予内质网应激抑制剂牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）、ROS阻断剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）、NF-κB抑制剂Bay11-7082,以及敲低ATF-4和XBP-1后,再给予TMAO刺激,通过免疫印迹实验检测ALP、BMP-2蛋白水平及通过茜素红染色检测钙化结节。动物实验:使用野生型C57BL/6雄性小鼠（12-14月龄）,分别喂正常饮食（CTRL）、高胆碱饮食（HCD）、高脂饮食（HFD）、高胆碱高脂饮食（HFCD）以及高胆碱高脂+DMB饮食（HFCD+DMB）,于16周后取小鼠血清检测TMAO水平,取小鼠瓣膜组织进行HE染色以及BMP-2免疫组化染色。结果:1.TMAO在钙化性主动脉瓣疾病组和非钙化主动脉瓣疾病组的比较:HPLC-MS/MS检测显示钙化性主动脉瓣疾病患者的血浆TMAO水平为2.87（2.11-4.90）μmol/1,高于非钙化性主动脉瓣疾病患者的1.90（1.35-2.57）μmol/l。多因素logistics回归方程分析显示TMAO与钙化性主动脉疾病密切相关。2.TMAO对主动脉瓣间质细胞成骨反应的影响:免疫印迹检测显示BMP-2、ALP蛋白水平随着TMAO刺激浓度升高而逐渐升高。茜素红染色检测显示TMAO刺激下主动脉瓣膜间质细胞钙化结节形成增加。3.TMAO对主动脉瓣间质细胞内质网-线粒体应激的影响:免疫印迹检测显示ATF-4、XBP-1s、CHOP蛋白水平随着TMAO刺激浓度升高而逐渐升高;IRE-1α磷酸化水平随着TMAO刺激时间而逐渐升高,在6小时达到最高,随后下降;TMAO刺激主动脉瓣膜间质细胞后其MMP降低,ROS水平升高,同时电镜显示线粒体及内质网体积变大。4.TMAO通过内质网-线粒体应激通路对成骨反应的影响:内质网应激抑制剂TUDCA和ROS阻断剂NAC能降低TMAO诱导的ATF4、XBP-1s、CHOP蛋白水平升高及降低IRE-1α磷酸化水平,降低ROS水平升高以及线粒体及内质网体积变大。内质网应激抑制剂TUDCA和ROS阻断剂NAC能降低TMAO诱导的BMP-2、ALP蛋白表达增多以及钙化结节形成。敲低ATF4和XBP-1能降低TMAO诱导的BMP-2、ALP蛋白表达增多。5.NF-κB在TMAO通过内质网-线粒体应激诱导成骨反应的影响:NF-κB磷酸化水平随着TMAO刺激时间而逐渐升高,在4小时达到最高,随后下降。内质网应激抑制剂TUDCA和ROS阻断剂NAC能降低TMAO诱导的NF-κB磷酸化水平。NF-κB活化抑制剂Bay11-7082能降低TMAO诱导的BMP-2、ALP蛋白表达增多及钙化结节形成增加。6.TMAO、主动脉瓣在不同饮食喂养小鼠模型中的改变:与正常饮食的小鼠相比,喂食HCD、HFD和HFCD小鼠的血清TMAO水平、主动脉瓣厚度及瓣膜组织中BMP-2蛋白水平增加。与HCD饮食的小鼠相比,喂食HFCD小鼠的血清TMAO水平、主动脉瓣厚度及瓣膜组织中BMP-2蛋白水平增加。与HFD饮食的小鼠相比,喂食HCD小鼠的血清TMAO水平升高,主动脉瓣厚度及瓣膜组织中BMP-2蛋白降低。通过给予TMA形成抑制剂DMB,与HFCD小鼠相比,喂食HFCD+DMB小鼠的血清TMAO水平降低及主动脉瓣厚度减轻。结论:1.钙化性主动脉瓣疾病患者组血浆TMAO水平升高。钙化性主动脉瓣疾病与TMAO显著相关。2.TMAO能诱导主动脉瓣间质细胞的成骨反应。3.TMAO能诱导主动脉瓣间质细胞的内质网-线粒体应激反应。4.TMAO可通过内质网-线粒体应激通路促进主动脉瓣间质细胞的成骨反应。5.TMAO可通过内质网-线粒体应激通路诱导NF-κB磷酸化,促进主动脉瓣间质细胞的成骨反应。6.补充高胆碱或高脂肪饮食可提高血清TMAO水平并加重主动脉瓣病变,通过抑制TMAO生成,主动脉病变能减轻。
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