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7-脱氢胆固醇（7-DHC）作为合成维生素D3的关键医药中间体,具有重要的应用价值。目前7-DHC的生产以化学合成法为主,存在环境污染问题。为了探究7-DHC的发酵法合成,本文以酿酒酵母为底盘,从阻断竞争途径、打通限速步骤、全局调控等方面展开研究,构建了 7-DHC从头合成途径,并在此基础上探索了途径的亚细胞区室化定位对7-DHC合成的影响。首先,以前期构建的YXWP113菌株（敲除GAL80使GAL体系受葡萄糖浓度调控）为出发菌株,过表达甲羟戊酸途径限速酶tHmg1p将角鲨烯的产量提高到354.00 mg/L,为后续的甾醇合成提供充足的前体。随后,通过敲除ERG6阻断竞争途径以合成7-DHC的直接前体7-脱氢链甾醇,并在该位点引入目前报道活性最好的Gallus gallus来源的DHCR24（编码甾醇C-24还原酶）,实现了 7-DHC在酿酒酵母中的从头合成（YG015）,其产量达到51.70 mg/L（5.92 mg/g DCW）。由于Erg4p-6p具有广泛的底物谱,在敲除ERG6的基础上进一步阻断ERG5有利于减少对关键前体（7-脱氢链甾醇）的竞争,从而较大幅度地提高 7-DHC 的产量,YG017（ΔERG5/6）的产量达到 139.72 mg/L（17.04 mg/g DCW）,而且YG017中角鲨烯含量相较于YG010下降至249.13 mg/L。此外,ERG4/6的双敲除菌株（YG016）相较于ERG6单敲除菌（YG015）以及ERG4/5/6三敲除菌株（YG018）相较于YG017的产量皆稍有下降,说明在敲除ERG6后再敲除ERG4反而不利于7-DHC的合成。酿酒酵母中7-DHC生物合成途径由于角鲨烯易积累可分成两个部分:前鲨烯途径和后鲨烯途径途径。首先,为了进一步增强前体供应从而提高产量,通过全局调控因子加强整条甾醇合成途径基因的表达。在YG017的基础上敲除ROX1并过表达UPC2-1得到菌株YG022,7-DHC产量达到217.68 mg/L（37.56 mg/g DCW）,同时角鲨烯产量上升至475.94 mg/L。随后,为了将积累的角鲨烯尽可能转化为7-DHC,对后鲨烯途径进行了强化,以实现上下游途径之间的代谢流平衡。通过分别过表达ERG2、ERG3、ERG2/ERG3、ERG1、ERG11、ERG1/ERG11加强了后鲨烯途径关键酶的表达,发现ERG2/ERG3的组合表达对于产量的影响不大,而将ERG11置于较强的PGAL1启动子下表达并将ERG1置于相对较弱的PGAL10启动子下表达,得到的菌株YG034产量最高,摇瓶产量可达到281.73 mg/L（46.78 mg/g DCW）。而且,其角鲨烯的积累大幅度减少,从YG030的521.26 mg/L（84.23 mg/g DCW）下降至 YG034 的 51.81 mg/L（8.03 mg/g DCW）。Erg2p的底物为酵母甾醇,其在麦角固醇缺失的菌株中可替代麦角固醇作为膜成分。虽然ERG2/ERG3的组合表达对于产量的影响不大,但这可能是由于内质网定位的Erg2p/Erg3p并不是途径此时的限速酶,而通过将Erg2p/Erg3p重定位于膜上可能会通过利用本由于空间限制无法转化的酵母甾醇,将其转化为7-DHC的直接前体（7-脱氢链甾醇）从而增加7-DHC的合成效率。在YG022的基础上,尝试将Erg2p-GGGGS-Erg3p、DHCR24p以及Erg2p-GGGGS-Erg3p/DHCR24p重定位于细胞膜（通过与PMSeV-c在N端融合表达）或者过氧化物酶体（通过与ePTS1在C端融合表达）。发现将DHCR24p和Erg2p-GGGGS-Erg3p同时定位于质膜上时,7-DHC产量从217.78 mg/L（YG040）提高至270.15 mg/L（YG044）,而当 DHCR24p 和 Erg2p-GGGGS-Erg3p 同时定位于过氧化物酶体时,产量从233.95 mg/L（YG050）上升至275.28 mg/L（YG053）。说明质膜和过氧化物酶体中皆存在可被DHCR24p和Erg2p-GGGGS-Erg3p利用的甾醇底物。最后,在过表达内质网定位的 Erg1p 和 Erg11p 的基础上（YG034）,将 DHCR24p 和 Erg2p-GGGGS-Erg3p共定位于质膜以及过氧化物酶体中（YG061）,7-DHC产量达到357.53 mg/L（63.12 mg/g DCW）。此外,将DHCR24p和Erg2p-GGGGS-Erg3p单独定位于质膜、过氧化物酶体或者共定位于两者,其角鲨烯含量皆不下降,其中YG061相较于YG034其角鲨烯含量从51.81 mg/L 上升至 76.50 mg/L。本研究围绕甾醇合成途径的内源竞争、关键中间体的积累与转化,以及甾醇的胞内分布及其与酶定位之间的矛盾展开研究,最终有效提高了 7-DHC的生物合成效率,为7-DHC合成的工业化生产提供了具有潜力的出发菌株。同时,这项研究也为其他甾体类物质的生物合成提供了方法借鉴。