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目的:在神经系统中,钙离子作为一种重要的第二信使,对很多功能的调节起着至关重要的作用,例如神经元兴奋性和突触的可塑性。而当钙离子在胞内聚集时,即发生钙超载时,会导致神经元损伤或者死亡。细胞内发生钙超载时,多种Ca2+依赖信号转导途径将被激活,进而激发多种复杂的时间和空间级联反应。主要机制有:氧化自由基生成增加、NO生成增多、线粒体破坏增加和细胞骨架被破坏。它通过对细胞程序死亡(PCD)、细胞凋亡的抑制作用和神经生发的刺激作用直接发挥其神经保护功能。最近有研究表明,血管内皮生长因子(The vascular endothelial growth factor,VEGF)不仅是一种具有血管生成和提高血管渗透压特性的缺氧诱导蛋白,而且有像血管生成一样的神经营养和神经保护特性。VEGF也是许多间接神经保护过程中的中介物,包括:血管生成,提高血脑屏障对葡萄糖的通透性,抗氧化剂活化作用。VEGF也表达于神经元的表面通过与特定的受体结合,保护神经元在缺氧和葡萄糖缺乏等危险条件下免于死亡。最近有研究表明,在急性分离的海马神经元中,VEGF还可以通过钾通道的kv1.2蛋白酪氨酸磷酸化抑制延迟外向整合钾电流。另有文献报导在海马脑片,VEGF可以抑制由电刺激兴奋性突触通路所诱导的突触后电位。但是,在神经系统的生理病理学改变中,VEGF对神经元电压依赖钙通道有何影响则鲜见报导。本实验通过电生理学研究和激光共聚焦钙成像技术来探究VEGF是否通过提高神经元电压依赖性钙通道的激活电压即激活特性,从而减少了钙离子经电压依赖性钙通道进入神经元细胞内,抑制了细胞内钙超载,进而发挥其神经保护作用。方法:1将原代海马神经元以0.5×106密度接种于小培养皿中,正常情况下培养7天,再加入VEGF(100ng/ml)孵育24小时,而对照组只加入同等剂量的培养基孵育24小时,然后在相同的实验环境中进行全细胞膜片钳实验记录,观察VEGF对培养的海马神经元全细胞钙电流的作用。2我们用Fluo-4/AM标记原代培养海马神经元胞内Ga2+,应用共聚焦激光扫描显微镜(confocal laser scanning microscope,CLSM)连续扫描高钾(KCl)刺激前后细胞内钙荧光的强弱,间接反映细胞内游离钙离子浓度变化。检测VEGF预处理对高钾诱发的细胞内钙超载的影响。结果:1在相同条件下进行全细胞膜片钳实验记录。取出小培养皿,用标准细胞外液清洗,然后加入记录钙电流的电极外液,将细胞膜钳制电压定位-80mV,刺激电压为-60mV+40mV,以10mV的步阶电压递增,波宽为300ms,分别记录两组神经元细胞的全细胞钙通道电流,并转化为电流密度。对照组和VEGF预处理组分别在去极电压为-10mV和20mV时达到电流密度最大值(2.32±0.16 pA/pF,n=12和2.27±0.15 pA/pF,n=10),且电流密度最大值应用统计学分析t检验无统计学差异(p>0.05),表明VEGF并未影响全细胞钙电流最大值。2将对照组和VEGF预处理组电流密度曲线经Boltzmann方程拟合,对照组和VEGF预处理组的半数激活电压为-34.2mV(n=12)和-4.0mV(n=10),经统计学分析,二者具有统计学差异。这说明VEGF预处理改变了培养海马神经元的激活特性,提高了其激活电压,使其更难激活。3对照组和VEGF预处理组在加入高钾溶液后均出现细胞内钙浓度快速升高,之后缓慢下降。VEGF预处理组细胞内钙离子浓度升高幅度明显低于对照组,这说明VEGF预处理抑制了高钾(根据能斯特方程计算其终浓度相当于-20mV的去极电位)诱发的细胞内钙离子浓度升高,对照组和VEGF预处理组钙离子荧光密度统计学分析存在统计学差异(对照组,706.88±56.37%,n=11;VEGF预处理组,450.55±31.05%,n=9)(P<0.05),说明VEGF可抑制神经元胞内钙超载。结论:VEGF通过提高神经元电压依赖性钙通道的激活电压即激活特性,减少了钙离子经电压依赖性钙通道进入神经元细胞内,从而抑制了细胞内钙超载,进而发挥其神经保护作用。