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研究背景：卵巢癌是妇科恶性肿瘤中死亡率最高的恶性肿瘤,在年龄介于55-74岁妇女所患的恶性肿瘤中,卵巢癌是第五位常见导致死亡的癌症。大多数卵巢癌患者被确诊时已属晚期,卵巢癌的治疗通常先进行手术治疗,然后再采用以铂类及紫杉烷为基础的联合化疗。晚期卵巢癌患者在经过理想的肿瘤细胞减灭术后,使其残余病灶的直径小于1厘米,再给予手术后的后续化疗,其中位生存时间也就刚刚超过4年。由于对化疗耐药卵巢癌细胞克隆的生长,几乎所有患者最终会出现卵巢癌的复发并随着疾病的进展而导致死亡。因此,发现新颖有效的治疗方法对卵巢癌的治疗是绝对有必要的。血管内皮生长因子(VEGF)是一种强烈的促血管生长因子,它能增加血管内皮细胞的通透性,刺激血管内皮细胞的分裂及游走。VEGF已被认为在肿瘤的生长及侵袭方面起着重要作用,它已成为肿瘤治疗方面一个新出现的靶点。以往的研究已经证实卵巢癌细胞表达VEGF,近来研究显示卵巢癌患者血清中VEGF水平呈现显著地升高。VEGF参与了卵巢癌的进展和腹水形成,是一个重要的与卵巢癌浸润,转移和腹水形成相关的生长因子。已有报道把VEGF作为一种评估卵巢肿瘤标志物及预测卵巢癌患者预后的预测因子。近来研究已经表明,在哺乳动物中小干扰RNA(siRNA)能通过对生物学上保守结构的RNA进行干扰,从而抑制相应靶基因表达。RNA干扰具有高度序列特异性,能使靶蛋白表达关闭。许多研究已经证实RNA干扰能阻断多种类型哺乳动物病毒复制,抑制癌肿生长。RNA干扰已经被开发成为反向遗传学的一个强有力的工具,并且已显示出广阔的治疗学上应用前景。本研究中,我们对卵巢癌细胞系CaoV3通过siRNA对其VEGF的表达进行了基因沉默,并评估VEGF表达下调对细胞增殖、细胞调亡及浸润相关蛋白表达的影响。期望能为靶向VEGF的卵巢癌基因治疗提供体外实验依据。第一部分VEGF靶向siRNA制备与转染及干扰效果检测目的：制备VEGF靶向siRNA并转染至CaoV3,明确VEGF靶向siRNA是否能特异及有效地沉默CaoV3细胞VEGF基因表达。材料与方法：细胞培养人上皮性卵巢癌细胞系CaoV3购自ATCC公司(美国组织培养库)。细胞放置于含有10%胎牛血清加链霉素／青霉素的RPMI-1640培养液中培养,保持培养箱的温度在37℃,CO2浓度为5%,95%空气湿度。siRNA制备与转染VEGF特异性siRNA片段试剂盒BLOCK-iTTM Complete Dicer RNAi购自于美国Invitrogen公司,按制造商的说明制备siRNA。VEGF基因的引物为5’-GAA CTT TCT GCT GTC TTG G-3’(上游引物),和5’-TTT TCT TGT CTT GCT CTA TCT-3’(下游引物)；LacZ引物序列5’-ACCAGAAGCGGRGCCGGAAA-3’(上游引物),5’-CCACAGCGGATGGTTCGGAT-3’(下游引物)。将细胞置于含有30ng siRNA和5μl脂质体的2000转染试剂进行转染,经过48小时转染后,细胞被收获为下一个实验作准备。本实验中lacZ d-siRNA作为RNA干扰阴性对照组,不加d-siRNA作为RNA干扰空白对照组。定量逆转录多聚酶链反应(qRT-PCR)当VEGF-siRNA进行48小时转染后,用实时荧光定量qRT-PCR对VEGF mRNA的表达进行检测,总RNA由购自美国公司的TRIzol试剂提取后,加入RNA酶游离胰脱氧核糖核酸酶Ⅰ,在37℃下孵育30分钟,然后加入20μl含有反转录酶和随机六聚物引物的反应混合物进行逆转录。VEGF的引物与"siRNA制备与转染”中使用的引物相同,用Beta-actin作为内参,其扩增引物为：5’-GTG GAC ATC CGC AAA GAC-3’(上游引物)和5’-AAA GGG TGT AAC GCA ACT AA-3(下游引物)’。qRT-PCR采用Applied Biosystems 7900HT system with the SYBR(?) Premix Ex TaqTM kit (TaKaRa),按照制造商的说明书进行。蛋白质印迹(Western Blot)用于Western Blot检测VEGF蛋白的一抗为鼠抗人-VEGF单克隆抗体,(Santa Cruz,美国,sc-7269,1：500稀释),等量提取的蛋白装载到SDS/PAGE胶上并被分离后,再转移到PVDF膜上,然后用含有5%脱脂奶粉的TBST液封闭1小时,接着再用一抗在常温下孵育2小时,膜再用TBST液洗涤4次,然后再用抗鼠IgG-HRP(DAKO)在常温下孵育1小时,最后蛋白用ECL体系进行检测。蛋白相对表达量=待测蛋白的光密度值／内参的光密度值。结果：靶向siRNA下调CaoV3细胞株VEGF的表达VEGF靶向siRNA与lacZ d-siRNA(阴性对照)瞬时转染CaoV3细胞48小时后,VEGF mRNA表达水平在空白对照、阴性对照与VEGF d-siRNA组分别为1.64±0.07,1.61±0.04和,0.48±0.02, VEGF靶向siRNA对VEGF mRNA表达的抑制率为70.02%(P=0.000),然而lacZ d-siRNA转染至CaoV3细胞对其VEGF mRNA的表达没有影响(P>0.05)。Western-blot结果进一步证实了这种表达减少。VEGF d-siRNA组CaoV3细胞VEGF蛋白的表达水平(0.31±0.07)与空白对照(0.82±0.08)、阴性对照组(0.81±0.09)相比显示了显著的减少,VEGF靶向siRNA对VEGF蛋白表达的抑制率为62.21%(P=0.000)。这些数据显示siRNA能在：mRNA及蛋白水平强力抑制CaoV3细胞VEGF的表达。结论：VEGF靶向siRNA在体外能特异性及有效地抑制CaoV3细胞VEGF mRNA及蛋白的表达。第二部分siRNA靶向干扰VEGF对卵巢癌细胞增殖、凋亡及侵袭力的影响研究目的：明确siRNA靶向干扰VEGF能有效地抑制CaoV3细胞增殖,诱导细胞凋亡,降低细胞侵袭潜能。材料与方法：细胞培养人上皮性卵巢癌细胞系CaoV3购自ATCC公司(美国组织培养库)。细胞放置于含有10%胎牛血清加链霉素／青霉素的1640培养液中培养,保持培养箱的温度在37℃,CO2浓度为5%,95%.空气湿度。siRNA制备与转染VEGF特异性siRNA片段试剂盒BLOCK-iTTM Complete Dicer RNAi购自于美国Invitrogen公司,按制造商的说明制备siRNA。VEGF基因的引物为5’-GAA CTT TCT GCT GTC TTG G-3’(上游引物),和5’-TTT TCT TGT CTT GCT CTA TCT-3’(下游引物)；LacZ引物序列5’-ACCAGAAGCGGRGCCGGAAA-3’(上游引物),5’-CCACAGCGGATGGTTCGGAT-3’(下游引物)。将细胞置于含有30ng siRNA和5μl脂质体的2000转染试剂进行转染,经过48小时转染后,细胞被收获为下一个实验作准备。本实验中lacZ d-siRNA作为RNA干扰阴性对照组,不加d-siRNA作为RNA干扰空白对照组。细胞增殖测定细胞增殖测定使用溴标法试剂盒(Roche Diagnostics),按照制造商的说明进行测定。简单地说,BrdU溶液加入到培养基中,2小时后弃去培养基,细胞用FixDenat溶液在常温下固定30分钟,然后弃去FixDenat液,细胞用抗-BrdU工作液孵育30分钟,最后免疫复合物由随后的底物反应探得。凋亡检测caspase-3的活性用CaspACETM Assay System kit(Colorimetric, Promega)测定,按照制造商的说明操作。将细胞置于98μl反应混合液中,再向其内加入半胱天冬酶底物。在常温下孵育4小时,吸光度由分光光度计在405nm波长处测定,然后计算caspase-3的比活性。再用TUNEL分析法对CaoV3凋亡情况进行了形态学上的测定,采用原位细胞死亡探测试剂盒,POD(Roche, Germany),按照制造商的说明进行测定。蛋白质印迹(Western Blot)用于Western Blot检测的一抗均为鼠抗人单克隆抗体,分别为抗-Survivin (Santa Cruz,美国,sc-17779,1：500稀释),抗-MMP2 (Santa Cruz,美国,sc-58386,1：1000稀释),抗-MMP9 (Santa Cruz,美国,sc-21733,1：1000稀释).等量提取的蛋白装载到SDS/PAGE胶上并被分离后,再转移到PVDF膜上,然后用含有5%脱脂奶粉的TBST液封闭1小时,接着再用一抗在常温下孵育2小时,膜再用TBST液洗涤4次,然后再用抗鼠IgG-HRP(DAKO)在常温下孵育1小时,最后蛋白用ECL体系进行检测。蛋白相对表达量=待测蛋白的光密度值／内参的光密度值。结果：1. VEGF靶向siRNA抑制CaoV3细胞增殖为了确定VEGF siRNA是否能影响CaoV3细胞的增殖,用溴标法测定细胞活性。VEGF siRNA组CaoV3细胞的增殖(0.67±0.30)与空白对照、阴性对照组相比(1.85±0.43与1.79±0.37)显著地减少了,细胞增殖抑制了62.56%(P=0.000)。在空白对照组与阴性对照组之间CaoV3细胞的增殖没有差异(P>0.05),因此VEGF表达的下调能抑制CaoV3细胞的增殖。2. VEGF靶向siRNA诱导CaoV3细胞凋亡检测caspase-3的酶活性来评估VEGF siRNA对CaoV3细胞凋亡的影响。结果VEGF siRNA组caspase-3的活性(1.83±0.11)与阴性对照组相比(1.04±0.09)显著地增加了,caspase-3的活性增加了75.96%(P=0.000)；而阴性对照组(1.04±0.09)与空白对照组(1.00±0.00)之间caspase-3的活性无差异(P>0.05)。为了检测VEGF siRNA在体外是否能诱导人卵巢癌细胞系CaoV3细胞的凋亡,细胞固定后用DNA末端标记法(TUNEL法)分析细胞的凋亡。用VEGF siRNA转染48h后,几乎所有的细胞从培养皿上消失了,留下来的少数细胞几乎100%凋亡阳性,然而,空白对照、阴性对照组细胞数量稳定地增长,并且凋亡细胞小于5%。3. VEGF靶向siRNA下调CaoV3细胞survivin、MMP2与MMP9蛋白的表达为了研究VEGF siRNA能否抑制CaoV3细胞表达survivin、MMP2与MMP9蛋白,用Western-blot法检测这些蛋白的表达水平,结果阴性对照组survivin、MMP2与MMP9蛋白的表达没有改变,但’VEGF siRNA组CaoV3细胞这三种蛋白的表达显著减少(P均=0.000)。结论：siRNA靶向干扰VEGF能有效抑制CaoV3细胞增殖,诱导细胞凋亡,降低细胞侵袭潜能。