目的:空间辐射,尤其是银河宇宙射线(galactic cosmic rays,GCR),含有高能带电粒子,拥有高传能线密度(liner energy transfer,LET),对暴露在太空环境中执行空间任务的宇航员具有潜在致癌风险。其中肺癌是宇航员执行太空飞行任务之后面临的最大癌症风险。动物研究发现高LET重离子导致肺癌的效率高于低LET电离辐射。然而其中的细胞分子机制仍不明确。DNA是电离辐射作用于机体的最重要靶点。通常认为电离辐射致癌的机理是错误修复的DNA双链断裂导致基因突变、基因组的不稳定性等的产生。活性氧(reactive oxygen species,ROS)在肿瘤的发生和发展中也具有重要作用,肿瘤细胞的胞内ROS水平常常高于与之对应的正常细胞。同时,在肿瘤发生发展进程中,原癌基因的激活和抑癌基因的失活也扮演着重要的角色。抑癌基因Reprimo作为P53基因的下游靶基因,其mRNA表达可被p53基因诱导,其蛋白水平的高表达使细胞周期停滞在G2期,从而抑制细胞增殖。本研究的主要目的是以人支气管上皮细胞NL20为研究对象,探讨低剂量高LET铁离子辐射对该种细胞产生的长期生物学效应,并与低LET电离辐射比较,为在细胞分子水平上探究空间辐射的致癌机制提供实验证据。首先采用低剂量α粒子与X射线对比,探讨NL20细胞受不同射线照射后其DNA损伤修复的情况。同时引入ATM抑制剂Ku55933,探究在照射前经Ku55933预处理对NL20细胞DNA损伤修复的影响。继而对细胞进行单次低剂量铁离子照射,探究受低剂量铁离子照射后NL20细胞中出现的长期生物学效应,并与X射线相比较,另外观察铁离子照射前经Ku55933预处理细胞对这些长期生物学效应的影响。最后探讨抑癌基因Reprimo对肺癌细胞H460辐射敏感性的影响。结果为揭示低剂量高LET空间电离辐射的致癌效应提供了坚实的细胞实验数据。方法:本研究在第一部分中采用53BP1 foci作为DNA损伤的标记物,用免疫荧光法检测NL20细胞在不同照射方式下其DNA损伤修复的情况,辐射方式包括α粒子和X射线;并通过结晶紫法检测Ku55933在不同浓度及不同孵育时间处理NL20细胞后其增殖能力的变化来确定Ku55933的最佳工作浓度;Ku55933预处理方法为照射前1 h在培养液中加入Ku55933,照射前更换为新鲜培养液;接着检测Ku55933预处理NL20细胞对其接受α粒子或X射线照射后DNA损伤修复的影响。实验第二部分主要是用10 cGy铁离子照射以及在照前使用Ku55933预处理NL20细胞;细胞受照后正常传代到相应代数(18代后),然后测定子代细胞的多项生物学指标。用微核形成率评估染色体异常,通过增殖实验测定细胞的增殖速度,采用流式细胞术测定细胞DNA含量以确定各时相细胞的比例,用ROS检测试剂盒检测细胞内的活性氧水平,并用免疫蛋白印迹检测SOD1、SOD2表达,最后用软琼脂集落形成实验检测细胞的转化。在第三部分中,以微核形成率、流式细胞仪检测细胞的周期分布为指标评估受单次低剂量铁离子照射支气管上皮细胞NL20后发生转化的子代细胞辐射敏感性的变化,并采用免疫蛋白印迹法检测发生转化的子代细胞抑癌基因Reprimo的表达情况。第四部分,在H460细胞中稳定转染Reprimo以及空载质粒,通过外源性增加H460细胞中Reprimo的水平,以微核形成率、克隆形成实验、流式细胞仪测定细胞周期分布来探究Reprimo对H460细胞辐射敏感性的影响。结果:1.首先采用单次照射方法处理NL20细胞,比较0.3 Gyα粒子照射组和0.9 Gy X射线照射组发现,X射线组53BP1 foci的阳性细胞率及细胞平均53BP1 foci数在照射后0.5、1和2 h时高于0.3 Gyα粒子照射组,但是在8 h后逐渐下降,在照后24 h时回到本底水平;而0.3 Gyα粒子照射组的53BP1 foci的阳性细胞率及细胞平均53BP1 foci数随着时间的增加和下降均不明显。并且分次照射的结果与单次照射的结果一致。随后,用结晶紫实验检测Ku55933在不同浓度不同孵育时间下对NL20细胞增殖的影响,在48 h内2、5、10和20μM Ku55933对NL20细胞增殖的影响无统计学差异,据以往文献报导,10μM Ku55933在抑制ATM磷酸化为最适浓度,所以实验选取10μM Ku55933为抑制ATM磷酸化的最适浓度。在照射前1 h加入Ku55933处理之后,无论是α粒子照射还是X射线照射,NL20细胞53BP1foci的阳性细胞率与单纯接受α粒子以及X射线照射组相比,53BP1 foci存在的时间均延长。2.用10 cGy铁离子照射处于指数生长期的NL20细胞;Ku55933预处理方法为照射前1 h在培养液中加入Ku55933,照射前更换为新鲜培养液;细胞受照后正常传代到相应代数(18代后),然后测定子代细胞的多项生物学指标。受铁离子照射细胞的子代细胞,其微核形成率及辐射敏感性与未照射组细胞的同代子代细胞相比无明显差异;然而,受单次铁离子照射细胞的子代细胞与未照射组细胞的同代子代细胞比较,其增殖速度减慢,细胞周期G1期减少,G2/M期有轻微阻滞,细胞内活性氧水平升高,SOD1、SOD2表达降低,软琼脂集落形成明显增多。而抑制ATM虽然可以显著逆转受照细胞的子代细胞发生众多变化,但却未能抑制软琼脂集落形成增多的现象。3.与未受照的相应代数对照组子代细胞相比,NL20细胞受10 cGy铁离子照射后第41代细胞的软琼脂集落形成明显增多。将未受照组子代细胞形成的软琼脂单克隆及受铁离子照射细胞的子代细胞所形成的软琼脂单克隆挑选出来后继续传代培养。在接受1 Gy X射线照射后,受铁离子照射细胞的子代细胞的单克隆细胞的微核形成率与相应未照射对照组子代细胞的克隆的细胞微核形成率相比明显增加,差异具有统计学意义。并且发现在接受4 Gy X射线照射后24 h,受铁离子照射细胞的子代细胞的克隆细胞与对照组组子代细胞的克隆细胞相比出现了更严重的G2/M期阻滞,差异有统计学意义。另外,受铁离子照射细胞的子代细胞的克隆细胞与对照组子代细胞的克隆细胞相比,受铁离子照射细胞的子代细胞的克隆细胞Reprimo蛋白明显降低。4.在接受1 Gy X射线照射后48 h,与转染空质粒的H460细胞相比,过表达Reprimo的H460细胞产生更多的微核;并且受照后过表达Reprimo的H460细胞的克隆形成能力更低。另外,接受4 Gy X射线照射后,过表达Reprimo的H460细胞比转染空质粒的H460细胞出现更多的G2/M期阻滞,差异有统计学意义。结论:1.无论是单次照射还是分次照射,α粒子导致的DNA损伤更复杂,细胞更难以修复。NL20细胞受α粒子或X射线照射前使用ATM抑制剂Ku55933预处理,可导致NL20细胞的DNA损伤存在的时间延长,即Ku55933抑制了细胞的DNA损伤修复。2.微核实验表明受单次0.1 Gy铁离子照射细胞的子代细胞并未出现明显的染色体异常。但是,受单次0.1 Gy铁离子照射细胞的子代细胞出现生长速度的减慢。并且,单次铁离子照射可导致受照细胞的子代细胞出现周期分布的微扰。同时,单次铁离子照射可导致受照细胞的子代细胞出现细胞内ROS水平升高,可能与细胞抗氧化系统功能的减弱有关。最重要的是单次低剂量铁离子照射能促进NL20子代细胞发生细胞转化。3.软琼脂克隆形成实验表明不仅只在受铁离子照射后的第18-22代细胞出现细胞转化,在受铁离子照射后的第41代细胞也出现了细胞转化。受铁离子照射后发生转化的子代细胞(即软琼脂克隆的第3-5代细胞)的辐射敏感性增加。受铁离子照射后发生转化的子代细胞(即软琼脂克隆的第3-5代细胞)Reprimo蛋白表达降低,提示Reprimo可能与辐射敏感性有关。4.过表达Reprimo的H460细胞的辐射敏感性增加。提示Reprimo与H460细胞的辐射敏感性相关。