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肝细胞癌是严重危害人类健康的恶性肿瘤之一，目前对于它的发病机制的研究主要从两方面展开：一方面，肿瘤的发生与基因的突变或异常表达有密切的关系，当细胞受到某些因素的作用，癌基因被激活发生基因点突变，基因易位，基因扩增和启动子插入等改变，过度表达或表达异常可致细胞癌变；另外，抑癌基因的杂合性丢失和突变等均能引起肝细胞癌的发生，但是肝细胞癌的发生机制远未阐明。为了寻找与肝细胞癌发生发展有关的特异基因，我所运用抑制性消减杂交(SSH)的方法，构建了肝细胞癌消减cDNA文库并获得93个克隆，P02是其中一个在肝细胞癌中高表达的基因。我所运用RNA印迹杂交的方法，证实了SSH筛选该基因的真实性，并用RT-PCR方法进一步证实了该基因在肝细胞癌中高表达的普遍性；通过同源性检索，发现P02mRNA与翻译控制肿瘤蛋白高度同源，并初步确定P02基因位于13q13-q14，同源性分析结果还显示P02mRNA在肝细胞癌发生发展的过程中，与细胞维持自身生存状态和免疫抵抗有关，并有可能参与了细胞的增殖过程。 另一方面是对肝细胞癌细胞学起源的探讨。最近提出了一种新的肝细胞癌的发病机制，即肝细胞癌由肝内未分化的肝干细胞或卵圆细胞异常分化而来。所谓干细胞指不分化而长期生存，且保持多种分化潜能的一种细胞群。卵圆细胞被证实是肝脏干细胞的子代细胞，是肝干细胞的一种，它具有独特的细胞形态，在酶化学，免疫组织化学、生物化学和分子生物学方面，同时兼备肝细胞和胆管上皮郑州大学2003年硕士毕业论文细胞角质素CK18，CK19及消减基因P一02在肝细胞癌组织中的表达细胞的许多表型特点，既可表达肝细胞型细胞角质素CKS和CK18，又可表达胆管细胞型角质素CK7和CK19。目前多数学者根据卵圆细胞的形态，表型特征，癌基因表达及体外转化等大量间接证据，认为肝细胞癌来源于卵圆细胞。 本实验的目的在于:1通过免疫组化方法，检测卵圆细胞标志物CKIS和CK19在正常肝组织，肝硬化组织和肝细胞癌组织中的表达，并观察卵圆细胞在不同组织中的增生状况，以期了解卵圆细胞在肝细胞癌发生中的作用。2通过原位杂交方法，观察P02基因在肝细胞癌中的表达定位，检测其在卵圆细胞中是否表达，将基因研究和肝细胞癌卵圆细胞源学说结合起来，探讨肝细胞癌的发生机制。 材料与方法:(l)免疫组化标本源于新乡医学院病理教研室，郑州大学第一附属医院，第二附属医院病理科，河南省肿瘤医院共43例肝细胞癌，27例肝硬化及8例肝囊肿，血管瘤及肝硬化旁经病理证实为正常的蜡块或组织。应用免疫组化sp法( Streptavldin一peroxidase，sp)检测CK18，CK19在正常肝组织，肝硬化组织，和肝细胞癌组织中的表达情况。(2)原位杂交标本来自郑州大学第一附属医院，第二附属医院及河南省肿瘤医院。采用冰冻切片原位杂交检测P02基因在15例肝细胞癌组织及其对应的癌旁肝硬化组织中的表达情况。(3)统计工具应用SPSS10.O版软件包，计数资料采用xZ检验及fisher精确概率法，计量资料采用t检验，并以。=0.05作为具有统计学意义的判断水准。 结果: (l)在正常肝组织中，CK18主要定位于胆管上皮细胞，呈棕黄色着色，靠近间质(汇管区)肝细胞呈浅棕黄色着色，其他位置，偶见几个细胞有着色，主要为胞膜着色，肝细胞胞浆内亦有浅着色，从靠近间质汇管区向肝小叶中央区棕黄色着色呈逐渐衰减的趋势，正常肝组织阳性表达率为25%;在肝硬化组织中，假小叶内肝细胞大多无着色，少见几处染为棕黄色的肝细胞，汇管区胆管，假胆管均着色，并可见强阳性着色的异型增生的细胞，并且出现染为深色的小细胞，这些细胞，体积约为正常肝细胞的l/2一1/4，胞核呈卵圆形，即卵圆细胞，肝硬化组织阳性表达率为29.63%。在肝细胞癌组织中，癌细胞和间质内假胆管均为强阳性表达，肝癌巢团周边常可见到成簇或散在分布的卵圆细胞，C K18在肝细胞癌组织的阳性表达率为65.12%。肝硬化组与正常肝组织之间无明显差异(P>0.05)，但肝细胞癌组与肝硬化组之间差异有显著性(P<0.01).郑州大学2003年硕士毕业论文细胞角质素CK18，CK19及消减基因P一02在肝细胞癌组织中的表达 CK19在正常肝组织中，胆管上皮细胞阳性着色，肝细胞呈阴性着色，在肝硬化组织中，间质中胆管、假胆管呈阳性着色，间质中可见阳性着色的卵圆细胞，肝细胞不着色，在正常肝组织中和肝硬化组之中的阳性表达率分别为O%和29.63%，二者之间无明显差异(P>0.05)。在肝细胞癌中，癌细胞，间质中假胆管中呈阳性着色，相对正常肝细胞呈阴性着色，并见卵圆细胞的阳性着色，肝细胞癌的阳性表达率为69.77%，肝细胞癌组和肝硬化组之间表达有显著差异 (P<0 .01)。 (2)正常肝组织中未见到卵圆细胞，在20/27例肝硬化组织中，靠近肝小叶边缘汇管区周围可见到CK18及CK19染色较深的小细胞，体积约为正常肝细胞的1/2一1/4，胞核呈卵圆形，胞浆稀少，即卵圆细胞。在35/43例肝细胞癌组织中亦可见到卵圆细胞的增生，它们位于癌巢周边，成簇分布或散在分布。CK18及CK19标记的?