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近年来,随着工农业的发展,大量的合成化合物不断释放到环境中,对环境、生物和人体健康造成了巨大危害。其中一些具有激素样作用的物质被称为环境内分泌干扰物(endocrine disrupting chemical,EDC),可导致人和动物内分泌系统功能异常(如性激素和甲状腺激素分泌障碍)、生殖器官异常(如精子减少、睾丸癌、乳腺癌)、神经系统异常(如智能低下、多动症)和免疫系统异常(过敏性疾病增加),严重威胁动物和人类的生殖健康。
由于诱导氧化损伤是EDC生殖毒性机制中一个最重要的途径,那么具有抗氧化活性的物质,尤其是食源性的植物性化合物,就可能预防EDC的毒性。茶多酚是从茶叶中提取出来的天然生物抗氧化剂,具有多方面的生物活性,其中抗氧化活性是茶多酚最基本的生物活性。由于EDC能引起白由基的产生和氧化损伤,而茶多酚具有清除自由基、螯合金属离子的抗氧化作用,为此,本研究通过体内、体外试验,研究茶多酚对活性氧和EDC引起的鸡胚氧化损伤的缓解作用,为茶多酚用于防治活性氧和氧化性EDC引起的氧化损伤提供理论依据。
1.生殖细胞培养模型的建立和应用
用胶原酶分散18胚龄鸡胚的睾丸,建立生殖细胞-体细胞的无血清共培养模型,培养液中添加了10μg/mL胰岛素、5μg/mL转铁蛋白和3×10-8 mol/L亚硒酸钠(称ITS培养液)。在该培养模型中,生殖细胞呈圆形生长,而体细胞呈梭状生长。促有丝分裂物质如胰岛素和转铁蛋白能维持生殖细胞的存活。胎牛血清能促进细胞的存活,但细胞生长过于旺盛以至难以观察生殖细胞形态的变化。而无血清ITS培养体系可防止体细胞的过度增殖,体细胞呈单层生长便于显微镜下观察生殖细胞的形态变化。用免疫细胞化学法进一步证实了生殖细胞呈c-kit(干细胞因子的受体)染色阳性,而体细胞呈阴性。自由基产生体系黄嘌呤-次黄嘌呤氧化酶(HX-XO)和农业来源的除草剂2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-dichlorophenoxyacetic acid,2,4-D,50μg/mL)对生殖细胞呈现毒性作用。从形态和功能两方面证明本实验所建立的鸡胚睾丸生殖细胞-体细胞无血清共培养模型可作为体外评价内源性激素和外源性物质如EDC生物活性的一种简易、快速、准确并且易于观察的离体模型,还可用于生殖毒理和繁殖营养调控机理的研究。
2.茶多酚对黄嘌呤-次黄嘌呤氧化酶引起的生殖细胞氧化损伤的缓解作用
自由基是机体许多生化反应的中间代谢物,在正常情况下处于产生与消除的动态平衡中。然而,过量的自由基就会损伤细胞,引起机体功能的障碍。在动物生产中,氧化应激通过自由基危害动物的健康,导致生产效率的下降。特别是动物的生殖细胞,对氧化损伤较为敏感,因此自由基的及时清除,如采用抗氧化剂,则有利于动物繁殖机能的正常发挥。本研究利用精原细胞-体细胞共培养模型研究茶多酚对鸡胚精原细胞氧化损伤的缓解作用,由次黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶体系产生的活性氧自由基可引起脂质过氧化产物丙二醛(MDA)的水平升高、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性降低,而茶多酚可将MDA水平、SOD和GSH-Px活性恢复到对照组水平,说明茶多酚通过抗氧化作用对活性氧引起的鸡胚精原细胞的氧化损伤具有保护作用。
3.茶多酚对2,4-D引起的生殖细胞氧化损伤的缓解作用(离体研究)
2,4-D是一种广泛使用的控制杂草生长的除草剂,是内分泌干扰物的一种。2,4-D被广泛应用到农业,并对接触的人和动物造成了潜在的危害。2,4-D可以通过职业接触,或从空气中、饮水中和土壤中的残留物危害人和动物的健康。2,4-D对家畜和实验动物具有胚胎毒、致畸毒和干扰生殖功能的作用。本试验利用精原细胞-体细胞体外无血清共培养模型研究茶多酚对精原细胞氧化损伤的缓解作用,结果表明:2,4-D可引起脂质过氧化产物MDA的水平升高、SOD和GSH-Px的活性降低,而茶多酚可将MDA水平、SOD和GSH-Px活性恢复到对照组水平,说明茶多酚通过抗氧化作用对2,4-D引起的鸡胚精原细胞的氧化损伤具有保护作用,其保护作用的机理可能是抑制脂质过氧化,清除自由基。
4.茶多酚对活性氧及2,4-D引起的鸡胚性腺氧化损伤的保护作用(在体研究)
本实验研究了茶多酚、HX-XO、2,4-D单独和联合作用对鸡胚性分化开始后性腺发育的影响。在孵化的第10天往气室内注入茶多酚(50μg/枚)、HX-XO(HX,0.5μmol,HX,0.25U/枚)、茶多酚+HX-XO、2,4-D(25μg/枚)和茶多酚+2,4-D,注射体积为50μl。在第19天取出睾丸、卵巢和肝脏,称重,然后进行形态学研究。结果显示:与对照组相比HX-XO、2,4-D均使睾丸、卵巢质量下降,肝脏质量没有明显变化,而添加茶多酚后睾丸、卵巢质量恢复到对照组水平。HX-XO、2,4-D对雌性和雄性生殖细胞表现出强烈的毒性作用,作用于睾丸会导致睾丸萎缩,曲细精管直径比对照组显著减少(P＜0.01),雄性的精细管结构也受到破坏,使生精细胞分化受到抑制,使大多数生殖细胞发生核固缩和胞质空泡化,细胞间隙增大。添加茶多酚后曲细精管直径有了明显的增加,生殖细胞也基本恢复了正常。以上在体研究结果表明茶多酚对活性氧及2,4-D引起的鸡胚性腺具有保护作用。
总之,茶多酚在体内外都能缓解氧自由基或环境污染物2,4-D引起的鸡胚性腺氧化损伤,茶多酚对鸡胚睾丸细胞氧化损伤的保护作用的机理可能是通过抑制脂质过氧化,清除自由基实现的。