粘质沙雷氏菌的原生质体诱变及及几丁质酶的研究

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本文为进一步提高粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)的几丁质酶活力,对本实验室分离并保存的一株粘质沙雷氏菌RZ21菌株,进行原生质体紫外线与NaNO2复合诱变,经过平板几丁质透明圈初筛与摇瓶复筛,筛选出一株高产几丁质酶的诱变株NU2,其所产几丁质酶的活力相比出发菌株提高了2.75倍,并对其产酶的培养基配方及培养条件进行了优化,最后做了几丁质酶的相关性质研究。  在诱变实验中,首先分别进行了原生质体紫外线和化学诱变剂NaNO2的单因子诱变,结果表明,原生质体紫外线诱变的效果要好于化学诱变剂的;在复合诱变试验中,菌悬液先经过化学诱变剂NaNO2诱变之后再经原生质体的紫外线诱变的方法具有较好的诱变效果,HC值相比出发菌株CK提高了60.8%,且菌株的遗传稳定性较好。  在培养基配方优化试验中,经过单因素试验与正交试验的优化,培养基配方确定为:最佳碳源为7.5g/L玉米粉,最佳氮源为5.0g/L蚕蛹粉,无机盐NaCl浓度为7.5g/L。除了传统碳氮源及无机盐条件的优化外,本研究结合几丁质酶的可诱导性,通过外加几丁质作为诱导剂提高了酶活的诱导效果。结果表明,胶体几丁质由于其颗粒较小,与酶的活性部位接触表面积较大等优点,诱导效果要优于粉末状几丁质,其中5mg/L的胶体几丁质的诱导效果最好;而粉末状150目的几丁质诱导效果略低于粉末状50目的几丁质。在培养条件优化方面,最佳培养条件为:培养温度30℃,初始pH8.0,装液量40mL/250mL,150rpm培养30h。在此最佳培养基配方及最佳培养条件下,粘质沙雷氏菌诱变株NU2所产几丁质酶的活力为410U,为初始培养基的4.23倍。  采用25L发酵罐培养粘质沙雷氏菌NU2诱变株,菌悬液依次进行高压细胞破碎、硫酸铵沉淀与透析等方法提纯几丁质酶。用纯酶进行水解胶体几丁质的酶学性质研究,结果表明该诱变株NU2所产的几丁质酶有热稳定性及pH稳定性较好等优点。该酶的最适反应温度为37℃,在4-60℃之间酶活比较稳定。最适反应体系为pH8.0的0.02M磷酸盐缓冲液,酶在pH5.0-9.0之间较为稳定。镁离子对酶活促进较大,而金属离子螯合剂EDTA则抑制酶的活性。
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