长链非编码RNA ANRIL促进头颈部鳞状细胞癌增殖的作用及机制研究

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背景及目的:长链非编码RNA参与多种疾病的发生与发展。研究发现长链非编码RNA ANRIL在某些恶性肿瘤组织中存在高表达的现象,具有促进肿瘤细胞增殖、侵袭迁移的作用,且可作为预测患者预后的指标。而长链非编码RNA ANRIL对头颈鳞癌的作用机制尚不明确。本课题探索长链非编码RNA ANRIL对头颈鳞癌的生物学作用及相关机制,为头颈鳞癌治疗寻找新的分子靶点。方法:1.通过RT-PCR检测49对HPV阴性头颈鳞癌患者组织和正常组织中长链非编码RNA ANRIL表达的差异。2.慢病毒介导的沉默ANRIL载体构建,稳定转染细胞株建立和敲低效率验证。CCK8、平板克隆、流式细胞仪分别检测ANRIL对头颈鳞癌细胞增殖的影响。3.生物信息学软件预测下游作用miRNA,免疫共沉淀、双荧光素酶报告基因实验共同验证ANRIL与miRNA的相关性。4.过表达及敲低miRNA质粒的构建,构建转染细胞株,并验证效率。CCK8、平板克隆分别检测miRNA对头颈鳞癌细胞增殖的影响。5.RT-PCR寻找miRNA下游靶基因,并通过双荧光素酶报告基因验证靶基因。6.敲低靶基因的siRNA转染头颈鳞癌细胞株,免疫印迹和RT-PCR验证敲低效率。CCK8、平板克隆、流式细胞仪分别检测靶基因对增殖的影响。7.免疫印迹检测靶基因对下游MAPK信号通路分子活性的影响。8.慢病毒稳转细胞株体内成瘤实验,同时利用腹腔注射靶基因抑制剂观察ANRIL和靶基因对头颈鳞癌增殖能力的影响。结果:1.RT-PCR检测发现ANRIL在头颈鳞癌组织中高表达,且与头颈癌病理分化程度相关,分化越差,表达越高,生存预后越差。2.构建慢病毒稳转ANRIL敲击细胞模型,PCR验证干扰效率达85%以上。ANRIL的低表达抑制头颈鳞癌细胞(CAL27,HN6)增殖,平板成瘤能力减弱,S期细胞减少。3.在体内ANRIL与下游miR-125a-3p表达负相关,ANRIL竞争性抑制miR-125a-3p在细胞内的表达。4.MiR-125a-3p过表达及敲低质粒构建后经PCR验证,效率达60%以上。且通过敲低及恢复实验验证ANRIL通过竞争性抑制miR-125a-3p的表达促进头颈鳞癌细胞增殖。5.MiR-125a-3p与下游靶基因FGFR1的表达具有负相关。敲低FGFR1的小干扰效率高达60%,FGFR1敲低后能有效抑制头颈鳞癌细胞的增殖能力,S期细胞减少。6.免疫印迹检测FGFR1敲低或过表达后,MAPK信号通路相关分子的活性,发现pp38,p-ERK,p-AKT表达降低或升高。结论:1.与正常组织相比,ANRIL在头颈鳞癌组织中表达升高,可作为头颈鳞癌诊断的候选指标。2.ANRIL在头颈鳞癌细胞系中通过竞争性抑制miR-125a-3p调节下游靶基因FGFR1的表达,从而激活MAPK信号通路,进一步促进头颈鳞癌细胞的增殖能力。3.通过抑制ANRIL的表达或使用FGFR1小分子抑制剂,头颈鳞癌的增殖受到显著抑制,提示ANRIL可作为头颈鳞癌治疗的潜在靶点。
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