论文部分内容阅读
褐飞虱Nilparvata lugens(Stal),半翅目、飞虱科(Hemiptera:Delphacidae),是一种专食性水稻重大害虫。以前研究表明药剂诱导褐飞虱雄虫的交配因子经交配传递使雌虫产生显著的交配后效应,但交配后效应的作用途径及分子机制不清楚。基于羽化后2 d交配与未交配褐飞虱雌虫的数字基因表达谱分析,发现交配后雌虫体内adenylyl cyclase 9(NlAC9)与 cAMP-dependent protein kinase(PKA)type Ⅰ regulatory subunit(NlPKAR)显著上调,且均属于cAMP/PKA信号通路;进一步研究结果表明NlAC9、NlPKAR与褐飞虱雌虫产卵和种群增长有关,且发现交配后雌虫卵巢内章鱼胺(OA)含量显著增加。OA是昆虫体内主要生物胺,具有神经递质、神经激素和神经调质三重作用,调控昆虫交配、排卵、产卵等多种行为和生理过程。因此,本研究提出“OA响应交配激活cAMP/PKA通路调控褐飞虱生殖”的假设。本论文主要研究结果如下:1、OA响应雄虫交配激活cAMP/PKA信号通路的特征(1)采用双抗体夹心法(E1ISA)检测发现交配后雌虫卵巢内OA含量显著增加,雌虫体内酪胺-β-羟化酶(TβH,OA重要的合成酶)、腺苷酸环化酶(AC)、cAMP依赖性蛋白激酶A(PKA)酶活、OA和cAMP含量也显著增加;实时荧光定量(qRT-PCR)结果表明交配后雌虫体内NlTβH和NlOctβ2R表达量上调,cAMP-PKA信号通路主要基因NlAC9、NlPKAR、NlCRREB1和NlCBP表达量也上调;蛋白免疫印迹(western blot)分析发现 cAMP-response element-binding protein 1(CREB1)的磷酸化(p-CREB1)水平显著增加。(2)未交配雌虫外源注射OA后cAMP含量、AC、PKA酶活、CREB1磷酸化水平、NlOctβ2R、NlAC9、NlPKAR、NlPKAc、NlCREB1表达与对照相比均有部分上升。上述结果初步证明OA响应交配激活下游cAMP/PKA通路。2、OA在褐飞虱生殖中的功能(1)OA/cAMP/PKA信号通路相关基因的时空表达特征分析:研究结果表明各基因在褐飞虱雌虫的成虫阶段均有较高表达;且在头部、脂肪体、卵巢组织中有特异性表达,暗示OA偶联cAMP/PKA通路在雌虫卵巢和脂肪体中发挥作用。(2)沉默NlTβH对雌虫生理生化和生殖力的影响:与dsGFP对照相比,NlTβH表达及OA含量显著下降,TA(tyramine,合成OA前体)含量上升;cAMP/PKA信号通路主要基因表达下调、p-CREB1蛋白水平和cAMP含量减少;AC和PKA酶活性降低;雌虫体重、脂肪体和卵巢可溶性蛋白含量、NlJHAMT、Met、Vg、VgR表达、JH Ⅲ滴度、Vg蛋白水平等均显著减少;雌虫产卵量、产卵历期及寿命显著降低。补偿JH后(dsTβH+methoprene)NlTβH、NlJHAMT、Met、Vg表达量及JHⅢ滴度、Vg蛋白水平显著上升;补救OA后(dsTβH+OA)NlTβH、Vg、VgR表达、Vg蛋白水平、OA含量、JH Ⅲ滴度显著上升。以上结果表明沉默NlTβH影响OA及JH合成进而调节雌虫生殖生殖,暗示OA与JH的协同作用。(3)OA与JH互作关系:virgin+OA处理显著增加NlJHAMT、Met的表达及JH Ⅲ滴度,表明OA影响JH合成;virgin+methoprene(保幼激素类似物)处理后NlTβH表达量、OA含量也显著增加,表明JH影响OA合成。(4)沉默OA/cAMP/PKA通路关键基因(TβH、Octβ2R、ACH、PKAR和CR显著抑制雌虫卵巢正常发育及卵巢小管内Vg的吸收积累;dsTβH,dsOctβ2R和dsCREB1处理后F1代种群数量、孵化率、种群趋势增长指数(population growth index,PGI)均显著降低。以上结果表明OA偶联cAMP/PKA通路与JH协同调控褐飞虱雌虫生殖。综上所述,本论文:(1)解析OA响应交配的特征;(2)阐明OA的生理功能;(3)揭示OA协同JH对褐飞虱生殖的调控。