西伯利亚蓼GST和CS基因双价载体构建及转酵母和烟草研究

来源 :东北林业大学 | 被引量 : 2次 | 上传用户:www474033605
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本研究从盐胁迫下的西伯利亚蓼cDNA文库中获得的GST和CS两个基因,分别构建了GST单基因、CS单基因及GST+CS双基因酵母单价和双价表达载体和植物单价和双价表达载体,成功获得了转单双价基因酵母和烟草,并进行了相关的分子生物学鉴定,分析了转基因酵母和烟草的抗盐、重金属能力,以及转单双价基因酵母和烟草的比较及协同互做关系,主要研究成果如下:  1、对西伯利亚蓼GST和CS基因进行了生物信息学分析,初步表明GST属于GST的Tau类家族,推测其在植物解除重金属和盐胁迫中起着重要作用。CS在信号肽引导下定位于细胞胞质,为胞质型蛋白。荧光定量RT-PCR分析显示,3% NaHCO3胁迫处理西伯利亚蓼2d后,GST和CS基因在叶和地下茎中均达到最大表达量,在茎中CS的最大表达量也出现在第2d,而GST基因最大表达量出现在第3d。GST和CS基因在去胁迫过程中在地下茎中的表达均上调,而在叶和茎中的表达呈下调趋势。  2、构建了GST基因的原核表达载体pET28a-GST并转入到大肠杆菌中,成功表达出分子量为26 kDa的特异蛋白。在3% NaHCO3胁迫状态下,表达GST基因的大肠杆菌(BL21-pET28a-GST)的生长明显快于对照(BL21-pET28a),表明GST诱导的蛋白在3% NaHCO3胁迫状态下的表达能够促进细菌的生长,初步证明GST基因具有抗盐特性。  3、构建了CS基因的真核表达载体pYES2-CS并转化到酿酒酵母中。实验表明,在NaCl和NaHCO3胁迫下,转基因酵母(CS+)的存活率明显高于对照酵母(CS-),并且转基因酵母菌体中GSH的含量和培养基中半胱氨酸含量均有增加,初步证明在酵母中过量表达CS基因能够提高酵母的耐盐性,证明CS基因具有抗盐特性。  4、构建了酿酒酵母单价表达载体pYES2-GST、pYES2-CS和双价表达载体pYES2-GC,并转入到酿酒酵母中,分别命名为转基因酵母ty-gst、ty-cs和ty-gc。在lmol·L-1 NaHCO3和5 mol·L-1 NaCl胁迫处理下,转基因酵母(ty-gst、ty-cs和ty-gc)的耐盐能力均高于野生型酵母(wy),而三者之间并无显著差别。在重金属胁迫处理后,转基因酵母菌(ty-gst、ty-cs和ty-gc)的耐重金属CdSO4和CuSO4能力均远高于野生型酵母(wy),其中转基因酵母ty-gc的耐受CdSO4的能力最高,转基因酵母菌ty-cs和ty-gc的耐重金属CuSO4能力高于转基因酵母ty-gst,说明GST和CS基因均具有耐受CuSO4的能力。而转双价酵母菌中CS基因可能协助GST基因提高转基因酵母耐受CuSO4的作用。  5、构建了植物单价表达载体pROKⅡ-GST、pROKⅡ-CS和双价表达载体pROKⅡ-GC,并转入到烟草中,分别命名为转基因烟草TY-GST、TY-CS和TY-GC。耐盐性实验显示,TY-GST、TY-CS和TY-GC烟草的SOD和POD活性均高于野生型烟草对照(WY)。TY-GC和TY-GST、TY-CS之间的POD活性存在显著差异,TY-GC烟草的 POD活性均高于任何一个单价烟草的POD活性。转基因植株的耐重金属实验证实,野生型烟草叶盘(WY)在重金属胁迫下很快就出现了衰老、失绿的症状,而转基因烟草(TY-GST、TY-CS和TY-GC)在重金属胁迫下,衰老、失绿的症状均比对照要迟缓的多,但3个转基因烟草之间并无显著差异。
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