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目的:通过在C57/B6J雄性小鼠皮下注射B16细胞建立小鼠黑色素瘤模型,验证槲皮素对黑色素瘤的治疗作用;采用B16和A375细胞系为主要研究对象,通过细胞增殖、细胞迁移、细胞侵袭、细胞凋亡等实验验证槲皮素在细胞水平对黑色素瘤的抑制作用,通过western-blot、q-PCR、Luciferase双荧光素酶报告基因等实验,对RIG-Ⅰ及其下游产物的定量分析,寻找和验证槲皮素治疗黑色素瘤的机制。方法:(一)槲皮素对小鼠黑色素瘤模型的治疗作用研究1.小鼠黑色素瘤模型的建立和评价将24只7-8周龄C57/B6J雄性小鼠采用随机数字表法平均分为4组,每组6只,适应性喂养3天后剔除小鼠后背部毛发,于剃毛区皮下注射1×106个B16细胞建立黑色素瘤模型。三天后可确认模型建立成功与否,剔除建模失败的小鼠,随即开始槲皮素灌胃治疗,分为对照组(CMC-Na)、低剂量组(3mg/kg/d)、中剂量组(15mg/kg/d)和高剂量组(75mg/kg/d),每次灌胃体积200 μL,连续灌胃两周。2.槲皮素治疗黑色瘤的疗效评价从造模开始每3天记录一次各组小鼠的体重并记录,制作体重变化曲线;从给药开始每3天测量一次肿瘤大小并记录,制作肿瘤生长曲线;给药结束后,称量小鼠体重和测量肿瘤大小和重量,剥离肿瘤后拍照记录并将肿瘤组织放置在液氮中保存备用,取小鼠腹股沟淋巴结放置在液氮中保存备用。通过测量小鼠的肿瘤体积和肿瘤重量评价槲皮素治疗黑色素瘤的疗效。(二)槲皮素对黑色素瘤细胞系的作用研究1.槲皮素对小鼠黑色素瘤细胞系B16的作用研究以B16细胞为研究对象,通过细胞增殖实验、细胞迁移实验、侵袭实验、划痕愈合实验、凋亡实验等,检测不同浓度槲皮素对B16细胞的作用,评价槲皮素对小鼠黑色素瘤细胞的抑制效果。2.槲皮素对人黑色素瘤细胞系A375的作用研究以A375细胞为研究对象,通过细胞增殖实验和凋亡实验,检测不同浓度槲皮素对A375细胞的作用,评价槲皮素对人黑色素瘤细胞的抑制效果。(三)槲皮素治疗黑色素瘤的机制研究1.槲皮素在B16细胞中的机制研究通过confocal检测槲皮素处理后B16细胞中RIG-Ⅰ的表达量变化,Luciferase双荧光素酶报告基因实验分析槲皮素影响RIG-Ⅰ表达的机制;通过western-blot和q-PCR实验验证RIG-Ⅰ及其下游信号通路分子TBK1、IRF3、IRF7、IFN-α、IFN-β、STAT1及IFN-Ⅰ诱导产生的ISGs的表达量验证槲皮素对RIG-Ⅰ/IFN-Ⅰ信号通路的作用。采用siRNA沉默技术,分别敲减B16细胞中RIG-Ⅰ及STAT1的表达,验证槲皮素的作用机制,并在同时沉默RIG-Ⅰ和STAT1的情况下用q-PCR检测相关信号分子的mRNA表达量,进一步阐明槲皮素的作用机制。2.槲皮素在小鼠体内作用机制的验证将小鼠的肿瘤组织和淋巴结组织使用超低温研磨仪处理后提取组织蛋白,采用western-blot实验分别检测肿瘤组织和淋巴结组织中RIG-Ⅰ及其下游信号通路分子IRF3、IRF7和IFN-β等的表达量,验证其在小鼠体内的作用机制。结果:(一)槲皮素能抑制小鼠黑色素瘤的生长连续给药2周后,75mg/kg/d的槲皮素与对照组比较,能显著抑制小鼠黑色素瘤的生长,表现为75mg/kg/d组小鼠的肿瘤生长速度明显低于对照组,给药结束后肿瘤的体积和肿瘤重量显著低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。(二)槲皮素对B16和A375细胞系的作用1.槲皮素抑制B16细胞增殖并促进凋亡分别给与不同浓度的槲皮素处理B16细胞24h,用CCK-8试剂检测细胞的增殖情况,从2.5 μM开始,与对照组比较细胞的增殖受到明显的抑制,差异有统计学意义(P<0.05),随着给药浓度升高,抑制程度逐渐升高;槲皮素处理时长48h时,亦是从2.5 μ M开始,细胞的生长受到明显的抑制,差异有统计学意义(P<0.05),其抑制程度在大于10μM浓度后趋于平稳。采用CTV染料标记B16细胞,用不同浓度槲皮素处理24h后发现,各浓度均能对B16的增殖有不同程度的抑制效果,且抑制程度呈剂量依赖性,浓度从2.5 μM开始其抑制效果与对照组比较有显著性差异(P<0.05),其抑制程度亦在大于10 μM浓度后趋于平稳。在集落形成实验中,槲皮素能呈浓度依赖性抑制B16细胞集落的形成,5 μM组和10 μ M组与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。于槲皮素处理B16细胞24h后,使用Annexin-V/PI染色发现槲皮素能促进B16凋亡,随着给药浓度的升高,凋亡细胞比例逐渐升高,从1μM组开始与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。2.槲皮素抑制B16细胞迁移、侵袭及划痕愈合在transwell小室中加入不同浓度槲皮素24h后,发现槲皮素能抑制B16迁移和侵袭,随着给药浓度升高,抑制程度逐渐升高,5 μM组和10 μM组与对照组比较差异均有统计学差异(P<0.001)。在加入槲皮素处理24后,发现细胞划痕愈合程度随着给药浓度升高逐渐降低,到达10 μ M时愈合程度与对照组比较有显著性差异(P<0.001)。3.槲皮素抑制A375细胞增殖并促进凋亡分别给与不同浓度的槲皮素处理A375细胞24h,用CCK-8试剂检测细胞的增殖情况,从20 μM开始,与对照组比较细胞的增殖受到明显的抑制,差异有统计学意义(P<0.05),随着给药浓度升高,抑制程度逐渐升高;槲皮素处理时长48h时,亦是从5μM开始,细胞的生长受到明显的抑制,差异有统计学意义(P<0.05),其抑制程度在大于60 μ M浓度后趋于平稳。不同浓度槲皮素处理A375细胞24h后,随着给药浓度的升高,凋亡细胞比例逐渐升高,从2.5 μ M开始,凋亡细胞比例与对照组比较,具有显著性差异(P<0.001)。(三)槲皮素在体内外的治疗机制1.槲皮素能通过激活RIG-Ⅰ的启动子并促进RIG-Ⅰ的表达通过免疫荧光检测槲皮素处理24h后B16细胞中RIG-Ⅰ的表达,证实槲皮素能上调细胞中RIG-Ⅰ的表达量;通过Luciferase双荧光素酶报告基因实验,发现槲皮素能激活RIG-Ⅰ的启动子序列,激活RIG-Ⅰ的产生后诱导产生IFN-β,随着给药浓度升高,IFN-β的产生逐渐增多,从5 μM开始,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.001)。2.槲皮素通过激活RIG-Ⅰ诱导产生IFN-Ⅰ及其它信号分子在B16和A375细胞中加入槲皮素后,能促进RIG-Ⅰ在蛋白水平和mRNA水平的表达,且促进效果呈剂量依赖性;在mRNA水平,RIG-Ⅰ表达升高能促进下游的TBK1、IRF3、IRF7、IFN-Ⅰ 及一些 ISGs,如 MX1、PML、TRAIL 及 STAT1 等分子的产生,且均随着给药浓度的升高表达量逐渐升高,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。在蛋白水平,槲皮素能显著上调B16和A375细胞中RIG-Ⅰ的表达量,以及以IRF7和STAT1为代表的下游信号通路分子的表达量,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。3.槲皮素在小鼠体内的作用机制在小鼠肿瘤组织和淋巴结组织中,RIG-Ⅰ、IRF3、p-IRF3、IRF7、p-IRF7、STAT1和p-STAT1的蛋白表达量随着给药浓度的升高表达量逐渐升高,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。4.通过siRNA基因沉默实验验证槲皮素的作用机制在B16细胞中使用siRNA沉默RIG-Ⅰ的表达,发现其下游的IRF7和STAT1蛋白表达量不再随着给药浓度的升高而升高,RIG-Ⅰ诱导产生的TBK1、IFN-α、IFN-β及ISGs的mRNA水平无明显变化,与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05);且沉默RIG-Ⅰ后槲皮素诱导的B16细胞凋亡与对照组比较,差异也无统计学意义(P>0.05)。在B16细胞中使用siRNA沉默STAT1的表达,RIG-Ⅰ和IRF7的蛋白表达量随着给药浓度的升高其上升趋势受到明显的削弱;在B16细胞中同时沉默RIG-Ⅰ和STAT1的表达,RIG-Ⅰ诱导产生的TBK1、IFN-α、IFN-β及ISGs的mRNA表达水平与只沉默RIG-Ⅰ组比较有进一步的下调。结论:(一)槲皮素能在体内抑制黑色素瘤生长槲皮素能抑制小鼠黑色素瘤的生长,在浓度为75mg/kg/d时表现出最佳抑制效果,肿瘤生长速度明显减慢、肿瘤大小及肿瘤体积明显减小,与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。(二)槲皮素能在体外抑制黑色素瘤生长槲皮素能抑制B16和A375细胞的增殖,促进细胞凋亡,且呈剂量依赖性;槲皮素能抑制B16细胞迁移、细胞侵袭及抑制细胞划痕愈合,抑制细胞集落形成。(三)槲皮素通过激活RIG-Ⅰ的表达诱导产生IFN-Ⅰ发挥抑制肿瘤的效果槲皮素能显著上调B16和A375细胞中RIG-Ⅰ的表达量,且证实槲皮素是通过激活RIG-Ⅰ的启动子从而促进RIG-Ⅰ的表达;RIG-Ⅰ表达上调后,其下游IRF3、IRF7、STAT1等分子的表达量在mRNA和蛋白水平均随着给药浓度升高逐渐升高;在小鼠体内,肿瘤组织和淋巴结组织中的RIG-Ⅰ、IRF3、IRF7、STAT1等分子的蛋白表达量均随着给药浓度的升高逐渐升高。说明槲皮素在体内外的疗效和机制是一致的。(四)槲皮素作用形成了 RIG-Ⅰ/IFN-Ⅰ/STAT1/RIG-Ⅰ正向循环的级联放大效应通过在B16细胞中沉默RIG-Ⅰ的表达证实槲皮素确是通过上调RIG-Ⅰ的表达从而诱导下游产物的产生而发挥抗肿瘤作用;通过沉默STAT1基因的表达证实RIG-Ⅰ、IRF7及STAT1对槲皮素的剂量依赖性受到削弱;同时沉默RIG-Ⅰ和STAT1使得RIG-Ⅰ和下游信号分子对槲皮素的剂量依赖性受到进一步削弱。说明在槲皮素的作用下,RIG-Ⅰ/IFN-Ⅰ/STAT1/RIG-Ⅰ之间形成了正向循环的级联放大效应,从而诱导产生更多的抗肿瘤效应分子。