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背景与目的:世界人口正面临严重的老龄化问题,中国也逐步步入老年社会,衰老机理的研究及老年性疾病的诊断和预防显得十分紧迫和重要。通常机体老化是缓慢渐进的,利用一些基因突变引起的早衰模型来研究正常衰老过程的分子机制具有重要的现实意义。酵母细胞培养容易,繁殖迅速,特别是存在众多的突变体,因而成为衰老研究的理想模型。A型核纤层蛋白前体(prelamin A)C末端不能被剪切或异常剪切50个氨基酸残基均导致细胞出现衰老表型,说明其C末端对细胞的衰老进程有重要影响,prelamin A特异识别因子Narf在该过程中可能起着重要作用,与细胞衰老密切相关。本研究在已经证明Narf与prelamin A相互作用的基础上,进一步研究Narf的细胞定位以及其与prelamin A结合的区域,为其功能研究奠定基础。通过构建Narf在酿酒酵母中的同源基因Narl基因敲除突变株,探讨了Narl在酵母细胞衰老和生长过程中的功能。
方法:将本实验室构建好的重组质粒pEGFP-N1-Narf单独转染或与pDsRed1-N1-prelamin A共转染HEK-293细胞,荧光显微镜下观察融合蛋白的定位情况;采用PCR方法扩增得到Narf不同区域的片段,插入到pACT2载体上构建一系列重组质粒,与已构建的含prelamin A cDNA的BD质粒共转化酵母AH109菌株,筛选能够发生相互作用的区域;利用同源重组的方法构建Narl基因缺失的酵母突变株,并分析其对酵母的寿命和生长的影响。
结果:Narf蛋白定位于细胞核中,并呈现点状高表达的现象,但当同时转染prelamin A时,Narf蛋白则主要与prelamin A共定位于核周,且点状高表达现象消失;Narf蛋白的C末端缺失对prelamin A与Narf的相互作用没有影响;NARl/narl基因缺失突变杂合菌株的寿命缩短且抗氧化应激能力下降。
结论:Narf蛋白与prelamin A蛋白在HEK293细胞中存在共定位,进一步说明它们在体内存在相互作用。Narlp在酵母的寿命机制和抗氧化应激中发挥着重要的作用,且通过能量限制能够使得NARl基因缺失杂合菌株的寿命得以恢复正常,其作用机制可能是通过提高抗氧化能力而实现的。这提示作为同源基因的Narf在人类衰老机制中可能同样也发挥着重要作用。