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研究背景癌症病人常常发生骨转移,侵犯周围软组织可以导致骨癌痛。由于现有临床治疗措施的有限性和现有药物不可克服的毒副作用及耐受性,癌痛病人未得到有效的治疗,其生活质量受到严重影响。因此,针对癌痛发生发展机制的深入研究将为其临床治疗提供新的思路,为癌痛病人带来新的希望。蛋白质泛素化修饰已被公认为是真核细胞内仅次于磷酸化的最重要的信号调节机制。泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system,UPS)是一种高效和高度选择性蛋白降解途径。UPS主要是通过降解细胞中各信号通路的抑制因子、激活因子进而发挥调节原始刺激信号的作用。在正常生理状态下,体内泛素水平在泛素活化酶和去泛素化酶的维持下保持动态的平衡。肿瘤、疼痛、创伤、应激等病理状态下,往往伴随泛素化平衡的失调,并导致蛋白降解程度的改变。泛素生物功能的执行与去泛素化酶(deubiquitinating protease,DUBs)功能密切相关的。泛素羧基末端水解酶L1(Ubiquitin carboxyterminal hydrolase L1, UCHL1)广泛分布在脑和脊髓的神经细胞,是目前研究比较深入的去泛素化酶家族重要成员之一。和其他去泛素化酶不同,UCHL1具有水解酶特性和不依赖ATPase的连接酶活性,因此UCHL1自然也成为研究蛋白质泛素化途径的新热点。研究发现：神经系统的泛素化平衡改变可能参与了慢性疼痛的发病机制。CCI大鼠脊髓PKA和UCHL1明显增加,其增加时间窗和痛觉过敏的发生时间一致,但具体机制不清。蛋白酶体抑制剂MG132可以提高神经病理性疼痛大鼠的痛阈,同时抑制脊髓神经元NF-κB、SP、降钙素相关基因肽和CGRP的表达。以上研究均提示UCHL1/ubiquitin可能参与疼痛的调控。那么,UCHL1/ubiquitin参与疼痛调控的具体机制又是怎样的呢?其在骨癌痛的产生过程中是否也发挥作用?本研究拟通过建立大鼠胫骨癌痛模型,观察脊髓水平UCHL1/ubiquitin分布、表达含量的变化,及其在脊髓的确切表达部位。并观察抑制UCHL1、或氯胺酮对胫骨癌痛大鼠疼痛行为学、UCHL1/ubiquitiin、和脊髓胶质细胞激活的影响。第一部分胫骨癌痛大鼠的痛觉过敏和胶质细胞激活改变目的 探讨脊髓水平胶质细胞激活在大鼠胫骨癌痛发病中的改变情况。方法采用Walker 256乳腺癌细胞构建大鼠胫骨癌痛模型。雌性SD大鼠(160-180g)随机分为：naive组、灭活Walker256乳腺癌细胞组(sham 组)、骨癌痛组(cancer-induced bone pain group,CIBP组)。CIBP组又按照时间点术前1d、术后1、3、5、7、10、14、21d分为8个亚组。米诺环素(或氟代柠檬酸)处理组分为：CIBP组、CIBP+Vehicle组、CIBP+米诺环素(或氟代柠檬酸)组。采用胫骨内注射Walker256乳腺癌细胞,建立胫骨癌痛模型；sham组动物注入等体积的灭活Walker256乳腺癌细胞。术前和术后不同时间点,测定大鼠机械痛阈值、自发性疼痛评分；免疫荧光染色法检测脊髓背角Iba-1与GFAP平均光密度的改变。结果(1)疼痛行为学：注射灭活Walker256乳腺癌细胞对大鼠痛阂无明显影响(P>0.05)。Walker256乳腺癌细胞接种组大鼠逐渐出现机械痛阈减低和自发性疼痛评分升高(P<0.05)。米诺环素或氟代柠檬酸可以抑制骨癌痛大鼠的痛觉过敏(P<0.05)。(2)免疫荧光染色法：随着肿瘤细胞接种,骨癌痛大鼠脊髓背角小胶质细胞和星形胶质细胞数量明显增加,胞体突起增生肥大,呈激活状态,Iba-1(小胶质细胞特异性标记物)、GFAP(星形胶质细胞特异性标记物)平均光密度(mean optical density,MOD)值显著升高(P<0.05),激活的小胶质细胞和星形胶质细胞主要分布在脊髓背角的Ⅱ～Ⅳ层。结论(1)随着Walker 256乳腺癌细胞接种,大鼠产生明显的痛觉敏化,提示骨癌痛造模成功。(2)骨癌痛大鼠脊髓背角小胶质细胞和星形胶质细胞激活明显；胶质细胞激活抑制剂可以减轻痛觉敏化,验证了脊髓胶质细胞激活参与大鼠胫骨癌痛的发生。第二部分UCHL1/ubiquitin在骨癌痛大鼠脊髓的表达和分布目的探讨脊髓UCHL1/ubiquitin在胫骨癌痛大鼠脊髓中的表达和分布情况。方法采用Walker 256乳腺癌细胞构建大鼠胫骨癌痛模型。雌性SD大鼠(160-180g)随机分为：naive组、sham组、CIBP 1d、CIBP3d、CIBP 7d、CIBP 14d、CIBP 21d组。分别于术前1d、术后1、3、7、14、21d,测定大鼠机械痛阈值、自发性疼痛评分；Western blotting法检测脊髓背角UCHL1/ubiquitin的表达改变；免疫荧光双标染色检测脊髓背角UCHL1/ubiquitin与Iba-1、GFAP及NeuN(神经元特异性标记物)的共表达情况。结果 (1)疼痛行为学：骨癌痛大鼠在术后出现痛觉过敏(P<0.05)。(2)Western blotting:骨癌痛大鼠术后3、7、14、21d脊髓水平UCHL1/ubiquitin表达量明显升高(P<0.05)。(3)免疫荧光染色法：免疫荧光双标染色发现脊髓背角UCHL1和NeuN之间共表达,但是和Iba-1和GFAP无共表达；ubiquitin和NeuN、Iba-1、GFAP均可以共表达。结论 (1)肿瘤细胞接种后,胫骨癌痛大鼠产生明显的痛觉过敏,同时脊髓水平UCHL1/ubiquitin表达上调。(2) UCHL1主要表达与神经元；ubiquitin表达于神经元、小胶质细胞和星形胶质细胞。上述结果提示：脊髓不同细胞分布的UCHL1/ubiquitin的上调参与调控大鼠胫骨癌痛的发生。第三部分抑制UCHL1对胫骨癌痛大鼠的痛觉过敏、胶质细胞激活的影响目的 探讨脊髓水平抑制UCHL1对胫骨癌痛大鼠痛觉过敏、UCHL1/ubiquitin和脊髓胶质细胞激活的影响。方法采用Walker 256乳腺癌细胞构建大鼠胫骨癌痛模型。骨癌痛大鼠分别于术后第14～16天,每天1次鞘内注射DMSO或LDN57444(2μg 或4μg/15μl)。于术前1d、术后1、3、7、11、14、16、18d,测定大鼠机械痛阈值、自发性疼痛评分；Western blotting法检测脊髓UCHL1/ubiquitin的变化；免疫荧光染色法检测脊髓背角Iba-1与GFAP平均光密度的改变。结果(1)疼痛行为学：骨癌痛各组大鼠在术后出现机械痛阈减低(P<0.05),和自发性疼痛评分升高(P<0.05)；与CIBP组相比,鞘内用药后,LDN57444(2μg或4μg)组大鼠机械痛阈值显著升高、自发性疼痛评分显著降低(P<0.05)。LDN57444 4μg不影响sham组大鼠的机械痛阈和自发性疼痛评分(P>0.05)。(2) Western blotting:与假手术组相比,骨癌痛大鼠术后脊髓水平UCHLl/ubiquitin表达量明显升高(P<0.05)；和骨癌痛+DMSO组比,LDN57444可以减少泛素的表达(P<0.05),但是不影响UCHL1的表达(P>0.05)。(3)免疫荧光染色法：癌痛各组大鼠脊髓背角小胶质细胞和星形胶质细胞激活增加,胞体突起增生肥大,呈激活状态(P<0.05)。与CIBP组相比,鞘内注射LDN57444可以明显抑制大鼠脊髓背角小胶质细胞和星形胶质细胞的活化(P<0.05)。结论(1)胫骨癌痛大鼠脊髓水平UCHLl/ubiquitin表达量明显上调；鞘内注射UCHL1抑制剂能够部分逆转胫骨癌痛大鼠已产生的痛觉过敏。(2)鞘内注射UCHL1抑制剂能减少ubiquitin表达,同时抑制胫骨癌痛大鼠脊髓背角小胶质细胞和星形胶质细胞的活化。上述结果提示UCHL1抑制剂可能通过抑制脊髓ubiquitin和胶质细胞激活,进而发挥镇痛作用。由于UCHL1/ubiquitin在脊髓背角的细胞分布不同,可以推测神经元-胶质细胞之间信号传递可能介导了胫骨癌痛的发生。第四部分鞘内注射氯胺酮的镇痛作用、及其对骨癌痛大鼠脊髓UCHL1/ubiquitin、胶质细胞激活的影响目的 观察鞘内注射氯胺酮的镇痛作用、及其对骨癌痛大鼠脊髓UCHL1/ubiquitin、胶质细胞激活的影响。方法采用Walker 256乳腺癌细胞构建大鼠胫骨癌痛模型。骨癌痛大鼠分别于术后第14～16天,每天1次鞘内注射NS或氯胺酮(60μg或120μg/15μl)。于给药前、给药后30、60、90、120、150、180min,测定大鼠机械痛阈值、自发性疼痛评分；Western blotting法检测脊髓UCHL1/ubiquitin的变化；免疫荧光染色法检测脊髓背角Iba-1与GFAP平均光密度的改变。结果(1)疼痛行为学：骨癌痛各组大鼠出现机械痛痛阈减低和自发性疼痛评分升高(P<0.05)；与骨癌痛组比,鞘内注射氯胺酮可以增加大鼠机械痛阈值、减低自发性疼痛评分(P<0.05)；氯胺酮(60gg或1201μg)组大鼠自主活动正常,未见瘫痪和死亡。(2)Western blotting:与假手术组比,骨癌痛大鼠术后脊髓水平UCHL1/ubiquitin表达量明显升高(P<0.05)；和骨癌痛+NS组比,氯胺酮不影响UCHL1/ubiquitin的表达(P>0.05)。(3)免疫荧光染色法：癌痛各组大鼠脊髓背角小胶质细胞和星形胶质细胞激活增加,胞体突起增生肥大,呈激活状态(P<0.05)。与NS相比,鞘内注射氯胺酮可以明显抑制大鼠脊髓背角小胶质细胞和星形胶质细胞的活化(P>0.05)。结论(1)胫骨癌痛大鼠脊髓水平UCHL1/ubiquitin表达量明显上调；鞘内注射氯胺酮能够部分逆转胫骨癌痛大鼠己产生的痛觉过敏。(2)；鞘内注射氯胺酮不影响UCHL1/ubiquitin的表达,但是可以抑制胫骨癌痛大鼠脊髓背角小胶质细胞和星形胶质细胞的活化,提示氯胺酮可以通过抑制胶质细胞激活(而非抑制脊髓UCHL1/ubiquitin),进而发挥镇痛作用。