哺乳动物肠道上皮层形成天然屏障将机体和多种肠腔内容物如食物,肠道微生物,消化产物和药物等隔离开来。肠道上皮细胞三至五天更新一次以适应肠腔内容物的持续变化,其完整性的维持依赖于对增殖,迁移,分化和凋亡信号的严格调控。协调活化参与这些过程的信号分子对维持肠道稳态,阻止炎症性结肠炎的发生至关重要。炎症性肠道疾病(inflammatory bowel diseases, IBD)如溃疡性结肠炎和Crohn’s氏病,与肠道反复发作不可控制的炎症密切相关,导致肠道组织广泛损伤,异常增生,最严重的并发症是结直肠癌,多项研究已经证实二者之间的清晰关系。尽管已经阐明很多信号通路参与调节维持正常肠道上皮细胞,然而在调节针对外界应急或者损伤情况下肠道组织稳态恢复的分子事件方面仍然知之甚少。肿瘤坏死因子α诱导的蛋白8(Tumor necrosis factor-a induced protein-8, TNFAIP8或Tipe)是第一个被鉴定出来的Tipe家族成员。多项研究表明Tipe可能通过抑制肿瘤细胞的凋亡发挥促癌作用。在肿瘤细胞过表达Tipe与肿瘤的增生、浸润和转移有关。与此相反,Tipe可能促进糖皮质激素诱导的正常胸腺细胞的凋亡。也有报道显示Tipe与活化形式的Gαi3相互作用调节细胞死亡和转化。Tipe基因过表达或者基因多态性与金黄色葡萄球菌感染,肿瘤的发生和牛皮癣的发生有关。但是对于Tipe在生理条件下和疾病状况下的精确作用知之甚少。考虑到Tipe在调节细胞死亡和增殖方面的作用,在本项研究中,我们利用葡聚糖硫酸酯钠盐(dextran sodium sulfate, DSS)诱导的实验性结肠炎模型研究Tipe在调节上皮细胞损伤和粘膜炎症中的作用。结果显示Tipe在急性结肠炎疾病过程中对于维持肠道稳态发挥至关重要的作用。研究目的1.构建Tipe基因缺陷小鼠并寻找Tipe基因缺陷小鼠的表型。2.探讨Tipe在DSS诱导的急性结肠炎模型中的作用及其机制。研究方法1.构建Tipe基因缺陷小鼠从德克萨斯基因组医学研究所获得Tipe基因缺陷的C57BL/6(B6)胚胎干细胞。将Tipe基因缺陷的诱骗载体插入到该基因唯一的内含子内。将胚胎干细胞注入小鼠囊胚中产生嵌合小鼠。在产生的六只嵌合小鼠中,其中五只是雄性小鼠,一只是雌性小鼠,从其中一只雄性小鼠获得该基因缺陷的稳定遗传。杂合子小鼠交配繁殖出纯合子Tipe-/-小鼠,一旦鉴定出纯合子小鼠,用特异性引物进一步验证确定无Tipe mRNA的表达。2.Tipe-/-小鼠表型分析六到八周小鼠处死后获取免疫器官并称重,匀浆研磨获取单细胞悬液,计算每个器官得到的细胞总数,并用流式抗体CD4, CD8, B220, Ly-6G, CD11b, CD11c, NK1.1, CD25, CD44, Foxp3, CD62L, and CD69检测所占百分比。3.结肠炎模型的诱导以3%或者4%DSS浓度(w/v)的DSS喂养八至十二周雄性小鼠诱导实验性结肠炎动物模型。在生存实验研究中,小鼠以含4%DSS的饮用水喂养五天,接着以正常饮用水喂养九天。在其它实验研究中,小鼠以含3%DSS的饮用水喂养五天,接着以正常饮用水喂养直至第七天实验结束。每天观察小鼠的疾病变化直至第七天处死小鼠,如果病情严重未至实验结束第七天,则立即处死小鼠。4.结肠炎模型的评价标准在每一次实验过程中每天观察小鼠并以临床疾病活动指数(disease activityindex,DAI)评价病情,DAI是基于体重丢失,粪便完整性和直肠出血情况三项指标(0-12分)的评价体系。具体计分标准如下：体重丢失(没有变化=0；,5%=1；6-10%=2；11-20%=3；.20%=4),粪便(正常=0；软,形成良好=1；软且不能形成粪块=2；腹泻=4),血便(无血=0；直肠可见血斑=1；直肠多处血斑=2；直肠血迹累计附近毛发=4).远端结肠组织切片经HE染色病理学评分标准如下(0-6分,综合炎细胞浸润和组织损伤)：固有层炎细胞浸润(零星分布炎细胞=0；炎细胞数增加=1；炎细胞融合至粘膜下层=2；透壁浸润=3)；组织损伤(粘膜无损伤=1；上皮细胞损伤=1；粘膜表面溃疡=2；粘膜广泛损伤并累计深层组织=3)。5.骨髓嵌合小鼠的产生从表达CD45.1的野生型小鼠和表达CD45.2的Tipe-/-小鼠的股骨和胫骨收集骨髓细胞,经尾静脉将一百万个细胞／每只小鼠转输给4.5Gy亚致死剂量照射的野生型小鼠和Tipe-/-小鼠,共产生四组嵌合小鼠：WT→WT(野生型细胞表达CD45.2转输给野生型细胞表达CD45.1)；Tipe-/-→WT(Tipe-/-细胞表达CD45.2转输给野生型细胞表达CD45.1)；WT→Tipe-/-(野生型细胞表达CD45.1转输给Tipe-/-细胞表达CD45.2；Tipe-/-→Tipe-/-(Tipe-/-细胞表达CD45.2转输给Tipe-/-细胞表达CD45.2).六周之后,以PE标记的抗体CD45.1和PercpCy5.5标记的抗体CD45.2用外周血白细胞检测小鼠嵌合程度。6.实时荧光定量PCR提取新鲜组织或者细胞总RNA并用2微克RNA反转录成cDNA,用实时荧光定量PCR检测基因的表达,用GAPDH作为内参计算基因相对表达。7.ELISA血清标本冻存于-80℃度备用。结肠组织标本在混有蛋白酶抑制剂的裂解液中充分裂解后,用BCA法测定蛋白浓度,细胞因子的含量表示为pg／mg组织总蛋白。按照说明书实施定量ELISA操作。8.组织病理学和免疫组化取出整个结肠并测量长度后,清洗远端结肠,固定于10%福尔马林,石蜡包埋。石蜡切片分别HE染色,Ki67染色和活化的caspase3染色。9.分离结肠上皮细胞分离结肠,用冷PBS冲洗并切成小块,将切成小段的结肠在含有EDTA/DTT的缓冲液中37℃缓慢摇动30分钟,用70微米的滤器过滤上清液获取单细胞悬液。经上皮细胞特异性的抗体EpCam染色后确定,约70-80%的细胞都是EpCam阳性的结肠上皮细胞。根据需要,分离的结肠上皮细胞在上皮细胞培养基中体外培养。10.分离结肠白细胞分离结肠固有层白细胞,首先将切成小段的结肠在含有EDTA/DTT的缓冲液中37℃摇动30分钟去除上皮细胞和上皮细胞层中的淋巴细胞。将剩余的结肠切成小块置于含有胶原酶,DNA酶和中性蛋白酶中37℃缓慢柔和摇动20分钟,用70微米的滤器过滤上清液获取的单细胞悬液即含有白细胞。11.凋亡分析分离结肠提取结肠上皮细胞,在上皮细胞培养基中过夜培养,用DSS处理,24小时以后7AAD和Annexin V染色检测细胞凋亡。12.细菌培养取远端结肠约3厘米,冲洗、称重、匀浆并梯度稀释,将不同稀释度的匀浆液涂于Brain Heart Infusion (BHI)琼脂板和Blood琼脂板上,37℃孵育过夜后计算细菌克隆形成数量。13.肠道通透性检测用FITC标记的葡聚糖检测体内肠道的通透性。WT和TIPE2-/-小鼠过夜禁食后经口腔罐服通透性示踪剂FITC标记的葡聚糖,用量为400mg/kg,四小时之后经内眦取血,血清中的荧光强度用激发波长为490nm、发射波长为530nm的荧光分光光度计测定,用梯度稀释的葡聚糖构建标准品计算血清中的浓度。14.血细胞计数处理小鼠之前,收集血液,用Drew Hemavet950FS仪器读取全血细胞数。研究结果1.Tipe基因缺陷小鼠的产生及表型利用基因诱骗技术在B6胚胎干细胞中靶向Tipe基因产生Tipe基因缺陷小鼠,诱骗载体包含病毒长末端重复基序、剪接受体位点、新霉素抗性基因和终止Tipe基因转录的多聚A尾。此靶向Tipe基因的表达导致短片段TIPE表达完全缺失,长片段Tipe仅表达氮末端前24个氨基酸,纯合子的产生用PCR技术进一步确认。Tipe基因缺陷并不明显影响小鼠的生长和发育,Tipe-/-小鼠的繁殖符合孟德尔遗传规律,无明显发育不良问题。淋巴器官的重量、结构和细胞组成正常。有研究报道下调Tipe基因的表达抵抗糖皮质激素诱导的胸腺细胞的凋亡,但是,地塞米松诱导的胸腺细胞的凋亡WT小鼠和Tipe-/-小鼠并无明显差异。2.Tipe-/-小鼠易感DSS诱导的结肠炎与WT小鼠相比,Tipe-/-小鼠没有明显的自发性疾病。但是DSS处理以后,尽管与WT小鼠饮用水的消耗相似,Tipe-/-小鼠的疾病程度明显加重,Tipe-/-小鼠第六天开始出现死亡,到第十天所有Tipe-/-小鼠全部死亡而40%的WT小鼠存活下来(p<0.01)。Tipe-/-小鼠体重丢失的严重程度明显高于WT对照组(p<0.05)。与此结果相一致,Tipe-/-小鼠的临床疾病活动指数也明显高于WT小鼠(p<0.01)。此外,DSS处理以后,Tipe-/-小鼠结肠重量比WT小鼠少(p<0.05)而结肠长度比WT小鼠短(p<0.05)。组织病理学检测显示Tipe-/-小鼠结肠部位的炎细胞浸润和粘膜破坏程度也明显比WT小鼠重。3.Tipe-/-小鼠炎症应答增强为了进一步明确Tipe在DSS诱导的结肠炎中的作用,我们用年龄和性别匹配的WT小鼠和Tipe-/-小鼠检测疾病相关的血液学指标和免疫学指标。DSS处理以后,与WT小鼠相比,Tipe-/-小鼠血液中的中心粒细胞数量明显升高(p<0.05),同时,Tipe-/-小鼠结肠中浸润的白细胞数量(p<0.01)也明显增加而脾脏相对变小(p<0.05)。Tipe-/-小鼠血清中IL-6和IL-17的含量也明显增加(p<0.001),与此相似,Tipe-/-小鼠结肠局部IL-6,IL-17A和IL-1β在蛋白水平(p<0.001)和mRNA水平(p<0.05)的表达增强,趋化性细胞因子CXCL2mRNA表达水平在Tipe-/小鼠的结肠内也明显增加(p<0.05)。4.Tipe在非造血细胞缺陷加重结肠炎尽管DSS处理的Tipe-/-小鼠加重炎症应答,造血系统和非造血系统都可能导致加重结肠炎这一表型。为了明确哪一部分起作用,我们利用骨髓移植技术产生四组嵌合小鼠。重组八周以后诱导结肠炎,接受WT和Tipe-/-骨髓细胞的受体WT的体重、疾病活动指数和结肠长度并无明显差异(p>0.05),提示造血细胞在Tipe-/-小鼠结肠炎表型中并不发挥主要作用。相反,与接受WT骨髓细胞的WT受体小鼠相比,接受WT骨髓细胞的Tipe-/-受体小鼠发生了更严重的结肠炎(p<0.05),提示非造血细胞在Tipe-/-小鼠结肠炎表型中发挥主要作用。5.Tipe/-小鼠结肠组织中细菌侵入增加肠道上皮细胞损伤破坏粘膜屏障能导致肠道内的细菌侵入组织并引发强烈的免疫应答,这也被认为是DSS诱导的结肠炎发病的重要原因之一。我们接下来检测DSS处理以后WT小鼠和Tipe-/小鼠结肠内的细菌数量,发现Tipe-/-小鼠结肠内的细菌数量明显高于WT对照小鼠(p<0.05),提示肠道内的细菌播散增强。6.Tipe基因缺陷影响上皮细胞的凋亡和增殖在结肠炎的发生过程中,结肠上皮细胞的凋亡增加和／或增殖降低可能能够解释Tipe-/-小鼠死亡率增加的表型。为了检测Tipe基因缺陷是否影响结肠上皮细胞的细胞死亡或增殖,从正常小鼠和DSS处理小鼠结肠中提取上皮细胞,AnnexinV和7AAD染色检测细胞死亡。与WT对照组相比,Tipe-/-小鼠细胞死亡增加(p<0.05)。另外,Tipe/-小鼠结肠组织中活化的AKT降低,提示增加的细胞死亡可能是降低了P13K-AKT的信号转导。Ki67是细胞增殖的内源性marker,Ki67免疫组化染色发现,与WT小鼠相比,Tipe-/-小鼠结肠组织内Ki67阳性细胞数明显减低(p<0.001),提示DSS损伤以后,上皮细胞的增殖修复需要TIPE的参与。此外,Tipe-/-小鼠结肠组织内活化形式的caspase-3阳性细胞数明显增加(p<0.001)。综上所述,Tipe-/-小鼠结肠上皮细胞死亡增多,继而增殖能力受损,可能是导致DSS损伤以后死亡率增加的原因。结论1.Tipe基因缺陷不影响胸腺T细胞的发育,Tipe基因缺陷不影响地塞米松诱导的胸腺细胞的凋亡；2.Tipe-/-小鼠对DSS诱导的结肠炎高度敏感；3.Tipe在非造血细胞缺陷加重结肠炎的发病程度；4.Tipe可能通过调节结肠上皮细胞的凋亡和增殖参与结肠炎的发生。创新点及意义1.首次构建Tipe-/-小鼠并探讨其表型；2.本研究首次发现TNFAIP8家族成员Tipe在结肠炎发生中的作用,为进一步探讨Tipe在病理生理条件下的生物学功能奠定基础；3.本研究初步阐明Tipe参与结肠炎发生的作用机制,可能为干预结肠炎的临床治疗提供潜在靶点。炎症性肠道疾病(inflammatory bowel diseases, IBD)包括溃疡性结肠炎和Crohn’s氏病是严重威胁人类健康具有潜在结肠和直肠致癌风险的疾病。溃疡性结肠炎呈现远端结肠并累及直肠的慢性、经治疗短暂缓解并反复发作的炎症性疾病特点,通常认为是结肠局部菌群和粘膜处免疫细胞异常相互作用导致的免疫紊乱。过度免疫应答产生的炎症介质是人类IBD和实验性结肠炎的致病元凶。目前结肠炎精确的发病机制尚未完全阐明,而实验性动物模型的建立有益于探索疾病发生的细胞分子机制。其中,葡聚糖硫酸酯钠盐(dextran sodium sulfate, DSS)诱导的实验性结肠炎模型是最常用的模型之一。DSS诱导肠道粘膜上皮细胞损伤,破坏粘膜屏障,肠道细菌与髓系免疫细胞接触引起急性免疫应答。DSS诱导的结肠炎与人类IBD有许多相似之处,如局限于结肠粘膜、体重减轻、腹泻、便血和结肠溃疡,组织病理学特点是存在广泛炎症,伴有大量巨噬细胞和粒细胞的浸润。TIPE2,肿瘤坏死因子α诱导的蛋白8-2(Tumor necrosis factor-a induced protein-8-like2),是TNFAIP8家族的成员,选择性表达于炎症组织、胸腺、脾脏、淋巴结、小肠粘膜等免疫器官和淋巴组织中以及造血细胞。研究发现,TIPE2通过负性调节机体固有免疫和适应性免疫应答维持免疫稳态。进一步研究发现,TIPE2的异常表达与自身免疫性疾病、慢性炎症性疾病、感染性疾病、代谢性疾病以及肿瘤的发生有关。另外,我们前期试验结果表明TIPE2通过作用于RacGTPases调节抗病毒和抗细菌固有免疫应答。然而,目前尚无报道TIPE2在IBD发生中的作用,鉴于IBD是细菌依赖性疾病,我们提出如下假说：TIPE2通过调节肠道抗细菌免疫应答在IBD的发生和发展过程中发挥重要作用。研究目的探讨TIPE2在DSS诱导的急性结肠炎模型中的作用及其机制研究方法参考第一部分研究结果1.TIPE家族成员在小鼠结肠组织中的表达我们首先检测TIPE2-/-小鼠结肠组织的表型,研究发现129S6/SvEvTac背景的TIPE2-/-小鼠约从八周开始出现自发性系统性炎症,而C57BL/6背景的TIPE2-／-小鼠则相对健康,无自发性IBD,肠道结构正常。在WT而非TIPE2-/-小鼠结肠组织中很容易检测到TIPE2mRNA的表达,在整个家族成员中,TIPE和TIPE1的表达比TIPE2的表达较高,而TIPE3的表达最低。另外,TIPE2-/-小鼠结肠组织中其它成员的表达水平与WT小鼠相似。2.TIPE2-/-小鼠抵抗DSS诱导的结肠炎在WT小鼠和TIPE2-/-小鼠的饮用水中加入4%DSS诱导急性结肠炎,发现TIPE2基因缺陷并不影响饮用水的消耗,然而TIPE2-/-小鼠的发病程度则明显减低。生存实验结果显示,到实验结束时,80%的WT小鼠死亡而TIPE2-/-小鼠全部存活(p<0.01)。从第五天开始,TIPE2-/-小鼠体重丢失的严重程度明显低于WT对照组(p<0.05)。与此结果相一致,TIPE2-／-小鼠的临床疾病活动指数也明显低于WT小鼠(p<0.01)。此外,DSS处理以后,TIPE2-/-小鼠结肠重量比WT小鼠多23%(p<0.01),TIPE2-/-小鼠结肠长度比WT小鼠长27%(p<0.01)。组织病理学检测显示TIPE2-/-小鼠结肠部位的炎细胞浸润和粘膜破坏程度也明显比WT小鼠轻,定量组织病理学评分结果显示TIPE2-/-小鼠也明显低于WT小鼠(4.6±0.6v.s2.6±0.4,p<0.05)。3.TIPE2-/-小鼠结肠局部炎症降低为了阐明TIPE2缺陷以后对结肠局部细胞因子产生的影响,我们检测了几种细胞因子的表达。DSS处理以后,WT小鼠结肠局部产生的促炎性细胞因子TNF-α,IL-6和IL-12明显升高,然而,相对于WT小鼠来说,TIPE2-/-小鼠产生的这些细胞因子则相对较低。其它细胞因子如IL-1β,IL-4和IFN-γ两组之间无明显差异。进一步分析结肠固有层内浸润的白细胞发现TIPE2-/-小鼠结肠内的中性粒细胞数(8.89±0.55v.s.2.92±0.32,p<0.001)、巨噬细胞数(12.63±0.63v.s.6.92±0.69,p<0.001)和树突状细胞数(24.04±3.65v.s.11.97±0.27,p<0.05),相对于WT小鼠来说均明显降低。值得注意的是,在WT小鼠和TIPE2-/-小鼠结肠内浸润的白细胞中Ly6G-CD11b+巨噬细胞是重要的细胞群体,而中性粒细胞和树突状细胞则是相对较少的细胞群体。4.TIPE2在造血细胞缺陷减轻结肠炎为了阐明哪类细胞在TIPE2介导的效应里发挥重要作用,我们利用骨髓移植技术产生四组嵌合小鼠。移植六周以后,我们发现受体小鼠90%以上的外周血白细胞来源于供体小鼠,证实嵌合成功。经DSS处理以后,KO→KO嵌合小鼠发病最轻。与WT→WT嵌合小鼠相比,KO→WT嵌合小鼠体重丢失减轻,DAI改善,保留结肠长度增加,组织病理学分数降低,这些结果提示TIPE2在造血细胞缺陷降低结肠炎的疾病程度。5.TIPE2-/-小鼠降低局部细菌播散和系统性炎症TIPE2-/-小鼠结肠局部的炎症应答减低,那么TIPE2是否影响到肠道细菌的扩散。DSS处理以后,相对于WT小鼠,TIPE2-/-小鼠结肠内细菌数明显减低,同时我们也发现TIPE2-／-小鼠血清中的FITC-dextran的荧光强度降低(p<0.05),提示TIPE2-/-小鼠结肠组织破坏和通透性较轻。与降低局部细菌播散相一致,TIPE2-/-小鼠外周血的白细胞总数(p<0.05)和单核细胞数(p<0.001)与WT小鼠相比也显著降低。另外,TIPE2-/-小鼠血清中促炎性细胞因子IL-6的含量也明显减少(p<0.001)。6.TIPE2基因缺陷不影响肠道菌群我们提取小鼠粪便基因组DNA,构建标准品用绝对定量的方法检测肠道内总的细菌量,接着用特异性的16S rRNA引物扩增三种代表性的细菌theEubacterium rectale-Clostridium coccoides, Bacteroides sp.和Enterobacteriaceae并绝对定量。我们发现与6至8周的WT小鼠相比,TIPE2-／-小鼠肠道内总的细菌含量和三种代表性的细菌含量并无明显差异,提示TIPE2基因缺陷不影响肠道菌群的结构和含量。结论1.在DSS诱导的结肠炎模型中,TIPE2-/-小鼠的发病程度明显降低；2.转输TIPE2基因缺陷的骨髓细胞能够明显拯救WT小鼠的结肠损伤程度；3.TIPE2-/-小鼠抵抗DSS诱导的结肠炎与降低结肠局部细菌的播散和系统性炎症有关。创新点及意义1.首次研究抗炎蛋白TIPE2在结肠炎模型中的作用,进一步拓展对TIPE2在不同疾病模型中作用的认识；2.本研究进一步证实了肠道菌群在结肠炎发生中的重要作用,通过控制肠道局部细菌的繁殖和播散可能会有效控制结肠炎的发生；3.本研究进一步阐明了结肠炎的炎症免疫机制,为免疫干预结肠炎的临床治疗提供了潜在靶点。