鸭瘟病毒UL19基因截段表达、蛋白纯化及抗体制备

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本论文对鸭瘟病毒UL19基因(GenBank登录号:EU195092)进行了如下研究:DPV UL19基因的生物信息学分析、UL19全基因的克隆与分段基因的原核表达、蛋白纯化及抗体制备,主要实验结果如下:1鸭瘟病毒UL19基因的生物信息学分析鸭瘟病毒UL19基因全长4143bp,编码1380个氨基酸,理论分子量为153.674kDa。蛋白相似性比对表明,该编码蛋白是高度保守的,因此认定UL19基因编码该病毒的主要衣壳蛋白。进一步分析表明该多肽不含信号肽,不是分泌蛋白;存在跨膜区的概率极低,初步估计应是膜外蛋白;疏水性区域分布广泛且比较分散;该多肽主要定位于细胞核、细胞质和内质网,并且内质网较多,可能与衣壳在宿主细胞核内装配然后转移到细胞质进一步加工成熟有关;三级结构预测发现,该多肽有一区域(第486-1050位)与数据库中已知的3D结构模型同源性较高。2鸭瘟病毒UL19全基因的克隆由于UL19全基因序列较长,PCR扩增该基因时易出现非特异性条带,因此在扩增条件的选择时比较苛刻。将PCR扩增出较纯的片段送公司测序并构建到pUC118-2载体,经测序后基本正确。然后将该基因构建到表达载体pGEX-4T-1进行诱导表达。经过转化不同的表达宿主菌以及各种条件摸索,并对相应的表达产物进行洗涤包涵体和过柱纯化,最终都没有得到理论值大小的重组蛋白,因此推测该基因在原核表达系统中不易表达,可能的原因是在诱导过程中,由于片段较长又无法正确折叠成高级结构,从而使表达中断。3鸭瘟病毒UL19基因的原核表达、蛋白纯化及抗体制备经过抗原表位分析,位于片段中间部分存在B细胞抗原表位的可能性较大。将该基因中间序列分成三个片段,分别进行T克隆及亚克隆,并转化至表达菌中诱导表达,三种表达产物主要以包涵体形式存在。经过各种纯化条件摸索,最终采用切胶纯化与洗涤包涵体的方法进行蛋白纯化,可以得到比较纯的蛋白。将纯化后的蛋白免疫兔子制备多克隆抗体,并用琼脂糖扩散实验测定效价。三个分段蛋白测得的效价分别为:1:8、1:16(弱)、1:16(弱)。
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