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胎儿成纤维细胞是常用的体细胞核移植供体细胞类型,但由于存在体外培养代次有限、转基因后损伤大等问题,限制了其在体细胞核移植中的应用。人端粒酶逆转录酶(hTERT)是端粒酶的核心成分,在端粒酶延长端粒过程中发挥重要的作用。本研究拟通过构建hTERT基因的真核表达载体,导入水牛胎儿成纤维细胞中,以期延长水牛胎儿成纤维细胞的体外培养寿命,获得一株经得起基因修饰和长时间药物筛选的细胞系,从而提高生产转基因克隆动物的效率。首先,本研究成功构建了hTERT基因的两个逆转录病毒表达载体pMXs-hTERT-NEO-GFP和pMXs-hTERT-IRES-NEO;并用组织块培养法分离培养得到了形态良好、增殖能力强的水牛胎儿成纤维细胞；同时,运用逆转录病毒法将构建好的载体pMXs-hTERT-NEO-GFP和pMXs-hTERT-IRES-NEO导入水牛胎儿成纤维细胞；通过高压筛选(800μg/mL G418)和恒压筛选(200μg/mL G418)相结合的方式得到阳性克隆并进行了扩大培养,获得了转hTERT基因的阳性细胞株。其次,比较了导入pMXs-hTERT-IRES-NEO载体的水牛胎儿成纤维细胞(phn-BFF).导入pMXs-hTERT-NEO-GFP载体的水牛胎儿成纤维细胞(phnG-BFF)和未转染胎儿成纤维细胞(BFF)中hTERT基因的相对表达量,发现hTERT基因在第5代和第30代phn-BFF的相对表达量差异不显著(P>0.05),但均极显著高于第5代phnG-BFF和第5代BFF (P<0.01),而第5代phnG-BFF的hTERT基因相对表达量也极显著高于第5代BFF(P<0.01)。同时,还对第30代phn-BFF的核型、细胞周期、端粒酶活性、端粒酶蛋白表达、软琼脂生长能力及p53基因表达量等生物学特性进行检测,结果显示：第30代phn-BFF的核型正常率为85%,其细胞周期与第5代BFF的相比,处于分裂期(S期)的细胞明显增多(phn-BFF38.6%>BFF25.5%,P<0.05),处于合成前期(G0+G1)的细胞减少(phn-BFF45.4%<BFF63.6%,P<0.05),细胞的增殖指数phn-BFF显著大于BFF (52.9%VS33.2%,P<0.05)；而且转染hTERT基因的phn-BFF能够表达端粒酶蛋白,且端粒酶具有活性；另外,软琼脂实验发现phn-BFF细胞没有转化生长的特性,无致瘤性特征；p53基因在第30代phn-BFF中的表达量显著低于第30代BFF (P<0.05),但与第5代BFF的P53基因表达量差异不显著(P>0.05)。最后,分别以第5代和第30代BFF、第30代phn-BFF作为供体细胞进行体细胞核移植(SCNT),探讨了转hTERT基因的BFF作为供体细胞对水牛核移植重构胚发育能力及胚胎发育相关基因表达的影响。结果显示：第30代phn-BFF作为供体细胞构建的重构胚其融合率、卵裂率和囊胚率与第5代BFF的相比差异不显著(P>0.05),但显著高于第30代BFF组(P<0.05)。采用Q-PCR分别检测第5代、第30代BFF和第30代phn-BFF构建的核移植重构胚囊胚Cdx2和Cx43基因的表达情况,发现第30代phn-BFF构建的核移植囊胚的Cdx2基因的相对表达量显著高于第30代BFF组(P<0.05),但与第5代BFF组差异不显著(P>0.05)；Cx43基因在第30代phn-BFF中的表达量高于第5代和第30代BFF组,且存在显著差异(P<0.05)。以上结果表明：水牛胎儿成纤维细胞导入逆转录病毒表达载体pMXs-hTERT-NEO-GFP和pMXs-hTERT-IRES-NEO可以表达翻译具有活性的端粒酶,且不影响细胞的正常生物学特性,并相对延长了细胞寿命；细胞经体外长时间传代培养后,表达端粒酶活性的水牛胎儿成纤维细胞作为核供体的核移植效果优于普通水牛胎儿成纤维细胞。