双歧杆菌是人体肠道内的固有共生菌群,与人体健康密切相关,因其益生功能特性而被广泛应用于婴幼儿及功能食品。由于抗生素的不合理使用,许多双歧杆菌菌株表现出抗生素耐药性且存在抗性基因水平转移的潜在风险。然而,目前国内外双歧杆菌抗生素耐药性监测及安全性评价体系仍不完善。基于上述问题,本课题针对中国人群肠道中常见的七种双歧杆菌(包括动物双歧杆菌、两歧双歧杆菌、青春双歧杆菌、短双歧杆菌、长双歧杆菌、假小链双歧杆菌和齿双歧杆菌),进行其对四环素、红霉素、克林霉素、氨苄青霉素、阿莫西林、甲氧苄啶、环丙沙星、氯霉素、利福平和万古霉素的耐药性分析,并基于比较基因组学方法对与其抗性表型相关的抗生素抗性基因进行分析,最后利用动物模型对其抗性基因的横向转移能力进行评价。主要结果如下:(1)建立双歧杆菌种水平抗生素耐药性数据库。通过比较其最小抑菌浓度(MIC)分布范围、覆盖的抗生素稀释度个数、模式MIC、MIC50、MIC90和耐药率等数据进行抗生素耐药性分析。结果表明,不同种双歧杆菌的MIC分布存在明显的种间差异。根据双歧杆菌属水平折点值,不同种双歧杆菌对10种抗生素的耐药率存在种间差异,相较于其他种双歧杆菌,齿双歧杆菌表现出较高比例的抗生素敏感性。(2)制定双歧杆菌抗生素种特异性初始微生物折点值(TMCOFFs)。为制定不同种双歧杆菌抗生素耐药判定标准以便区分敏感菌株与获得性抗性菌株,本研究基于57个双歧杆菌-抗生素组合(七种双歧杆菌与10种抗生素)的MIC频数分布数据,采用2种统计学方法(Turnidge和Kronvall)和目测法对双歧杆菌种特异性TMCOFFs进行制定并相互比较。统计发现,3种方法制定的折点值有68.42%的一致性,三种方法计算结果的一致性较高。TMCOFFs最终定义为三种方法所得的微生物折点值中值,且其与双歧杆菌属水平折点值存在54.69%的一致性。(3)双歧杆菌抗生素抗性基因分析。为进一步进行双歧杆菌抗生素耐药机制解析,通过比较基因组学方法对其抗性基因多样性和丰度、获得性抗性基因的分布、耐药表型与基因型关联、抗性基因的系统进化关系进行探究。研究发现,七种双歧杆菌对四环素类、大环内酯类、β-内酰胺类、糖肽类和叶酸代谢干扰抑制剂类抗生素抗性基因丰度存在差异,且其对10种抗生素抗性基因的多样性也存在差距。双歧杆菌中四环素、红霉素和克林霉素耐药表型与基因型间的相关性较高,其关键抗性基因对相应抗性表型的解释率均大于80%,而剩下七种抗生素基因型与表型间无明显相关性。基因tet(W)是介导双歧杆菌四环素抗性的关键抗性基因,可解释82.2%双歧杆菌四环素抗性表型;而erm(X)是介导红霉素和克林霉素共同抗性的关键基因,可解释84.8%双歧杆菌红霉素和克林霉素抗性表型,且绝大多数tet(W)和erm(X)基因为获得性抗性基因。系统进化分析表明,不同种双歧杆菌的tet(W)和erm(X)基因序列具有较高的相似度,同种双歧杆菌不同菌株的tet(W)和erm(X)基因序列具有明显的差异。(4)双歧杆菌四环素抗性基因tet(W)的横向转移风险评估。为进一步评估双歧杆菌四环素抗性基因tet(W)的水平转移能力,通过建立抗性基因转移小鼠模型,探究在无抗生素和有抗生素选择压力下双歧杆菌tet(W)基因的转移频率。结果发现,在整个实验过程中,均未检测到接合子,由此说明双歧杆菌菌株中的tet(W)基因不能在双歧杆菌与粪肠球菌间进行传播和转移,且四环素选择压力对tet(W)基因横向转移频率没有影响,小鼠粪便样本和肠道不同部位中的受体菌浓度均低于供体菌。