苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)是一种革兰氏阳性菌,在孢子形成时期产生的杀虫晶体蛋白被用于农业、医疗和林业害虫的防治已经超过了 60余年。它们的使用范围很广,在一定程度上替代了化学杀虫剂,在有机农业和林业有着广阔市场。这些市场得益于相比于化学杀虫剂的非靶标效果,Bt对靶标害虫具有较高的特异性。Bt的商业影响由于转Bt植物的种植而增加,将改良的毒素基因进行转化,使植物自身产生蛋白毒素。自从1996年转Bt基因植物首次商业化以来,世界各地已经种植了超过2亿多公顷的Bt作物。它的成功在很大程度上是由于杀虫蛋白的高效性和对非靶标昆虫的安全性。然而,随着Bt杀虫剂的广泛使用和转Bt作物的种植面积不断扩大,昆虫产生了一定水平的抗性,严重制约了 Bt杀虫剂的长期使用。其中Bt毒素受体的突变而导致的与毒素结合能力的变化是产生Bt抗性的重要原因之一。ABCC2被认为是迄今为止Bt Cry1A毒素最重要的受体之一,目前已有较多的相关文献报道。昆虫ABC转运蛋白家族还与色素运输、尿酸代谢、发育、化学农药杀虫剂抗性等方面有关。鳞翅目昆虫中ABC转运子家族C2(ABCC2)基因的突变被认为是昆虫对Cry1 A毒素产生高水平抗性的主要原因之一。ABCC2转运蛋白的6个胞外loops被认为是潜在的Cry1A毒素候选结合位点,但尚待详细研究。本研究表明棉铃虫HaABCC2基因在昆虫细胞中表达后产物主要定位于细胞膜上。为了研究Cry1Ac毒素是否与HaABCC2蛋白的哪个半转运蛋白结合,通过基因工程技术将HaABCC2转运蛋白拆分为两个半转运蛋白(half-transpoter)进行表达。单转TnH5细胞时,两者都定位于细胞质中。但当共转染TnH5细胞后表达,表达产物又重新定位在细胞膜上。推测两个半转运蛋白间存在相互作用,且两者各含有一部分膜定位信号,或者是相互作用影响结构,而结构影响定位。共转后所测得的Cry1Ac的EC50值是单表达的HaABCC2野生型的10倍左右,推测可能与共转后两者发生相互作用而共转运到细胞膜上的效率较低有关。为进一步确定HaABCC2蛋白的膜定位信号的位置,在HaABCC2-D1和HaABCC2-D2基础上分别构建了两个NBD缺失突变体。一个NBD缺失突变体再与另外一半的半转运蛋白(含NBD)共转。如果只缺失第一个NBD,共转时仍有部分表达产物能定位到细胞膜上,采用40 μg/mL的Cry1 Ac毒素处理时有将近40%的细胞发生病变。如果第一个半转运蛋白(含NBD)与第2个缺NBD的半转运蛋白共表达,表达产物不能定位到细胞膜上。采用40 μg/mL的Cry1Ac毒素处理时,没有细胞发生病变。这说明两个NBD都能够影响HaABCC2的细胞膜定位,但是第二个影响更大。在野生型HaABCC2蛋白上缺失第二个NBD的实验结果与上述类似。HaABCC2的NBD1和NBD2是胞内最大的两个loop,推测膜定位信号可能存在于两个NBD上,于是构建了 NBD1-HaABCC2-D2,在TnH5细胞中超表达后仍定位于细胞质中,说明膜定位信号与第一个跨膜结构域簇TMD1也有关。将其与HaABCC2-D1-del-NBD共转表达时重新定位到细胞膜上,并且对Cry1Ac仍有较高的敏感性(约为野生型的10倍)。推测HaABCC2的细胞膜定位与整个胞内loops的完整性有关。HaABCC4-like蛋白也定位在膜细胞上,而且它不能介导多种Cry毒素的毒力。将它拆分成两部分后共转TnH5细胞时表达产物也重新定位在细胞膜上,说明分拆蛋白可以组装成整体的现象广泛存在于ABC转运蛋白中。将HaABCC2的两个NBD分别替换 HaABCC4-like-D1 和 HaABCC4-like-D2 对应的 NBD,替换 NBD 后的HaABCC4-like突变体与HaABCC2-D2或HaABCC2-D1共转,并不能重新定位到细胞膜上,进一步证实HaABCC2的两个NBD不足以将其定位到细胞膜上,两种不同的ABC半转运蛋白可能不能相互作用。除NBD外,HaABCC2的细胞膜定位还与其他部分也有关系。总之,本研究表明,HaABCC2的两个半转运蛋白可以相互作用而共定位于细胞膜上,并介导Cry1Ac毒素的毒力,HaABCC2在细胞膜上的定位与NBD和胞内的其他loops都有关系,这些实验结果为研究毒素与受体的作用位点和昆虫对Bt毒素的抗性机制提供了重要的参考。