目的了解广州市部分医院铜绿假单胞菌不同耐药程度流行情况及其危险因素；探究不同耐药程度铜绿假单胞菌β-内酰胺酶、基因的分布和基因分型状况及其可能的耐药机制。方法收集2008年7月到2012年12月在广州某五所医院院内感染患者的铜绿假单胞菌348株，经鉴定后，采用回顾性查阅病例方法收集病史资料。348株PA进行药敏试验后，筛选敏感菌株、1-2类耐药菌株、多重耐药菌株及泛耐药菌株，分析其耐药现况及通过单因素和多因素采用无序多分类logistic回归分析1-2类耐药菌株、多重耐药菌株及泛耐药菌株感染的危险因素。运用双纸片复合法和双纸片协同法筛选PA产β-内酰胺酶（超广谱β-内酰胺酶、金属酶、AmpC酶）的情况，同时运用PCR扩增β-内酰胺酶的编码基因（NDM-1、TEM、PER、OXA-10、IMP、VIM）、氨基糖苷类钝化酶编码基因（ant(3″)-Ⅰ与aac(6′)-Ⅱ）、外膜孔蛋白Oprd2，整合子及gyrA、parC管家基因，然后运用PCR-RFLP的方法对整合子进行分型及检测gyrA、parC管家基因的QRDR片段的突变情况。最后分析五所医院感染菌株的β-内酰胺酶、耐药基因及管家基因突变的情况，并运用卡方检验分析β-内酰胺酶产生、耐药基因或管家基因突变与耐药菌株（包括1-2类耐药组、多重耐药组、泛耐药组菌株）的关系。采用脉冲场凝胶电泳方法对铜绿假单胞菌菌株进行分子分型，并运用Bionumerie6.0软件进行聚类分析，分析菌株间的亲缘关系及鉴定散发或暴发流行趋势。结果2008年-2012年间共收集348株铜绿假单胞菌，其中多重耐药组中MDRPA149例，多重耐药率为42.8%(149/348)，39株PDRPA，泛耐药率为11.2%（39/348）。MDRPA感染的患者中男性占63.3%(114/180)，中位数是73岁；PDRPA感染男性占59.0%（23/39）,中位数是74岁。PDRPA主要分布在重症加强护理病房（12/39），呼吸内科（11/39）和神经内科（8/39），MDRPA分布最多的亦为以上三个科室。 MDRPA与PDRPA的标本来源大部分来自痰,分别达81.1%(146/180)、82.1%（32/39）。PA对抗菌药物耐药性最高的前三位是β-内酰胺类的TIC44.8%、PIP39.7%、ATM34.8%，敏感性最高的是MEN74.1%，13种抗菌药物中除了LEV、ATM外，耐药率随着时间变化而呈现上升的趋势。单因素分析发现差异具有统计学意义的因素包括：手术、检出前入住ICU、使用碳青霉烯类抗菌药物、使用二代头孢抗菌药物、抗菌药物使用总天数、感染前住院天数、使用抗菌药物≥3种、混合感染、吸痰、机械通气、导尿管插管、鼻饲胃管插管。多因素分析发现（以敏感组为对照组）：1-2类耐药组的危险因素有吸痰(调整后OR=2.79,95%CI=1.09-7.12)；多重耐药组危险因素有曾使用碳青霉烯类抗菌药物（调整后OR=2.29,95%CI=1.02-5.15），检出前入住ICU（调整后OR=2.90，95%CI=1.22-6.91）；泛耐药组的危险因素有曾使用碳青霉烯类抗菌药物（调整后OR=5.94，95%CI=1.97-17.85）和机械通气（调整后OR=11.78，95%CI=3.14-44.20）。β-内酰胺酶的产生及其编码基因检测发现：348株菌产MBL酶占11.2%（39/348），产AmpC酶占12.9%（45/348）, ESBLs酶占12.1%（42/348）；各种产酶率在四组分布的差异具有统计学意义（P<0.05）。β-内酰胺酶编码基因NDM-1暂未检出，而TEM达43.4%（151/348），PER达22.7%（79/348），OXA-10达23.3%（81/348），IMP达15.2%（53/348），VIM达4.6%（16/348）；除了PER与IMP基因外，其余耐药基因在泛耐药组（PDRPA）和敏感组检出率差异都具有统计学意义。外膜通透性调控基因检测发现：OprD2的总的缺失率达19.5%（68/348）；1-2类耐药组、多重耐药组和泛耐药组的OprD2基因的缺失率与敏感组比较，差异具有统计学意义，其OR值分别为：1-2类耐药组（OR=12.57,95%CI=1.65-111.37），多重耐药组（OR=38.53,95%CI=5.21-285.19），泛耐药组（OR=66.08,95%CI=8.33-524.24）。氨基糖苷类钝化酶编码基因检测发现：aac(6＇)-Ⅱ基因携带率达24.7%（86/348），ant(3”)-Ⅰ达32.2%（112/348）；aac(6＇)-Ⅱ、ant(3”)-Ⅰ的基因的检出率在多重耐药组和泛耐药组中分别与敏感组比较，得多重耐药组中aac(6＇)-Ⅱ（OR=3.45,95%CI=1.68-7.07）、ant(3”)-Ⅰ（OR=3.13,95%CI=1.69-5.81），泛耐药组中aac(6＇)-Ⅱ（OR=11.11,95%CI=4.54-27.19）、ant(3”)-Ⅰ（OR=3.23,95%CI=1.42-7.38）,且具差异有统计学意义（P<0.05）。整合子检测结果：Ⅰ类整合子检出172株，占49.4%（172/348），未检出Ⅱ、Ⅲ类整合子；其中MDRPA的Ⅰ类整合子达53.7%（80/149）。PDRPA中Ⅰ类整合子达84.6%（33/39）；庆大霉素、妥布霉素、阿米卡星、哌拉西林、替卡西林、亚胺培南、美罗培南、左氧氟沙星、环丙沙星、氨曲南、头孢他啶、头孢吡肟12种抗菌药物在整合子阳性菌株中的耐药率明显高于整合子阴性组，差别具有统计学意义（P<0.05)。多重耐药组、泛耐药组的整合子的检出率分别与敏感组比较差异，得多重耐药组（OR=2.43,95%CI=1.43-4.15），泛耐药组（OR=11.53,95%CI=4.37-30.40），且差异均具有统计学意义（P<0.05)。喹诺酮耐药决定区突变情况：在162株喹诺酮耐药的铜绿假单胞菌，gyrA基因突变占40.7%(66/162)，parC突变占17.3%（28/162）； gyrA基因的QRDR片段突变主要发生在第83位氨基酸密码子的ACC→ATC，其编码的氨基酸由The→Ⅱe，与此同时，耐药菌株在132位氨基酸密码子(CAC→CAT)有一静止突变，该突变未引起氨基酸的改变，而parC测序结果表明QRDR片段突变主要位于第79位氨基酸密码子发生TCC→GCC的突变，该位点突变引起氨基酸Ser→Ala的改变；泛耐药组中gyrA与parC的QRDR片段的突变率与1-2类耐药组的菌株比较，得出gyrA （OR=3.93，95%CI=1.13-13.62）， parC （OR=1.36，95%CI=1.11-1.16），且差异均具有统计学差异（P<0.05）。PFGE分子分型结果：348株菌Dice系数为100%的PA一共有8对，分别为A、B、D、C、E、F、G、H型， PFGE为A、C、D、E、F型中同一型里两或三位患者均来自同一家医院，不但住院时间日期有重叠且同一个科室，加之耐药谱相似，容易导致患者间互相感染的发生，因此上述5型中的同源菌株考虑科室内交叉感染而产生。而B、G、H型的菌株同一型的患者均来自同一家医院，但检出科室不同，有发生科室间交叉感染的可能，感染途径还有待追究。泛耐药株的PFGE分型Dice系数在44.3%至97.1%之间， Dice系数在80%或以上的同源株有5组，同一型的菌株均来自同一家医院，共11株PDRPA,其余的28株均为散发。结论广州市院内感染PA菌株的耐药发生率较为普遍，除了LEV和ATM外，耐药率随着时间呈现上升的趋势。吸痰为1-2类耐药PA的危险因素；曾使用碳青霉烯类抗菌药物、检出前入住ICU为MDRPA的危险因素；机械通气、曾使用碳青霉烯类抗菌药物为PDRPA的危险因素。β-内酰胺酶及其基因（TEM、OXA-10、VIM）、氨基糖苷类钝化酶编码基因aac(6＇)-Ⅱ、OprD2基因的缺失、整合子、gyrA和ParC基因的喹诺酮耐药决定区突变为PDRPA产生耐药的主要机制。未发现PA大范围单克隆流行情况,大部分菌株呈散发流行趋势，但在同医院或病区存在轻微的克隆播散现象，ICU与呼吸内科出现频率较高，也有不同科室间出现交叉感染。