中国疾控中心2021年11月27日数据显示,截止至2020年底,我国现存105.3万HIV-1感染者中,97.8万感染者正在接受联合抗逆转录病毒疗法（combination anti-retroviral therapy,c ART）,仍有数万感染者未达到有效病毒学抑制。一项Meta统计分析结果显示,我国抗逆转录病毒药物治疗失败者中有近一半检测到耐药突变,且主要突变为HIV-1逆转录酶区（Reverse transcriptase,RT）的K103N、Y181C和M184V等。HIV-1耐药突变的产生以及耐药株的传播是导致联合抗逆转录病毒治疗失败的主要原因。因此,在HIV-1感染者首次治疗前和治疗失败后检测耐药突变十分必要。由于表型耐药检测和基因型耐药检测方法存在周期长,操作要求高等缺点,使得耐药监测未能广泛开展,因此迫切需要开发操作便捷且灵敏性高的检测方法。寡核苷酸连接方法（Oligonucleotide ligation assay,OLA）是一种能快速辨别已知单点基因突变的方法,已被尝试用于检测沙门氏菌以及HBV、HIV病毒的耐药突变。本研究针对中国主要流行的HIV-1耐药突变包括逆转录酶基因中的K103N、Y181C和M184V建立了OLA的检测方法,并对其检测下限、灵敏性以及阳性检出率进行评估。我们首先针对M184V突变设计了寡核苷酸探针,然后使用探针检测HIV-1 RT野生型（Wild-type）和突变型（Mutant,MUT）基因模板。探究各种因素对检测结果的影响,如连接温度、探针所带标记（地高辛、荧光素）、竞争引物以及探针数量。结果显示:1.连接温度过高会导致检测失败;2.带有荧光素标记的WT探针RTM184和带有地高辛标记的MUT探针RTM184V能够较好的区分野生型基因模板和突变型模板;3.竞争引物可以降低背景,另一方面也会影响检测的灵敏性;4.增加RTM184探针的数量可以提高检测M184野生型基因的灵敏性。根据以上结果对反应条件进行优化,建立检测M184V突变的OLA方法。在此基础上分别针对K103N、Y181C突变设计探针,用其检测野生型基因模板和突变型基因模板,结果显示探针的特异性良好,可以区分野生型模板和突变型模板。然后用针对三种突变设计的探针分别检测野生型基因模板、突变型基因模板或二者的混合基因模板评估其检测下限和灵敏性;将96例临床样本的OLA检测结果与基因型测序结果进行比较,评估该方法的检出率。结果显示:1.OLA检测下限低（K103N野生型和突变型模板的检测下限均是0.39 ng DNA;Y181野生型模板检测下限为0.78 ng;Y181C突变型模板的检测下限为3.12 ng;M184野生型模板检测下限为0.78 ng;M184V突变型模板检测下限为1.56 ng）;2.灵敏性高（OLA可以检测出混合基因模板中3%的K103N,3%的Y181C以及1%的M184V突变型基因）;3.阳性检出率高（96例样本的OLA检测结果与基因型检测结果的总体一致性为96.9%,其中K103N突变为100%,Y181C突变为95.8%,M184V突变为94.7%）。本研究构建的OLA方法灵敏、快捷、检出率高,有望后期成为我国HIV-1耐药监测的新方法。