大肠癌(colorectal cancer,CRC)是危害人类健康的恶性肿瘤之一,其发病率呈逐年上升趋势,并位于全球常见恶性肿瘤的第3位。手术是目前大肠癌治疗的首选方法,但化学药物是治疗大肠癌的重要手段。而天然来源药物或者是基于天然产物合成的衍生物在肿瘤治疗中已取得显著的效果,且因其毒副作用低、靶点多而越来越成为临床抗肿瘤药物研究的热点。法氏囊五肽和金雀异黄素均是天然来源的化合物。法氏囊五肽BP5(Bursopentin,Cys-Lys-Arg-Val-Tyr)是从鸡法氏囊中分离到的一种新的多功能性活性五肽。据报道,BP5能参与调节多条与抗肿瘤活性相关的细胞信号通路。然而,目前尚无相关文献报道BP5对肿瘤细胞生长抑制作用的研究。金雀异黄素(Genistein,Gen)广泛分布于葛根、槐角、金雀花、山豆根等豆科植物中,是很多中草药的天然活性成分之一。研究表明,Gen能诱导肿瘤细胞凋亡、抑制增殖、抑制多种药物的耐药性等。本研究首先对BP5抑制结肠癌HCT116细胞的作用及其机制展开了研究,研究发现BP5通过诱导G1期细胞周期阻滞、内质网应激以及线粒体介导的caspase依赖性的凋亡途径抑制结肠癌HCT116细胞生长。在此基础上开展了 BP5与抗肿瘤中药单体Gen的联合应用的初步研究,结果发现两者能协同抑制HCT116细胞的生长、诱导细胞凋亡和自噬。此外,通过收集扬州市中医院158例大肠癌病例,对大肠癌的临床分布、病理特征、中医证型及治疗方式等进行回顾性分析,结果表明,结肠癌和直肠癌在年龄、中医证型、治疗方法上具有明显差异,而在性别、病理大体分型、组织学分类、组织分化程度、临床分期、转移情况上并无明显差异性。本课题研究内容共分为三个部分。第一部分法氏囊五肽对结肠癌HCT116细胞增殖的作用及机制目的:探讨BP5对结肠癌HCT116细胞的抗癌作用及其可能机制。方法:用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)测定细胞活力。分别使用碘化丙啶(PI)和Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞周期和凋亡率。通过Western blot法检测细胞周期相关蛋白和凋亡相关蛋白来分析其作用机制。使用特异性siRNAs对IREI、ATF-6和PERK进行基因沉默实验。用H2DCF-DA绿色荧光探针染色法测定细胞内活性氧(ROS)。分别使用Fluo-3 AM和JC-1染色试剂盒检测细胞内Ca2+浓度和线粒体膜电位(△Ψm)。结果:BP5对HCT116细胞的增殖具有抑制作用,呈剂量-时间依赖性,并具有诱导细胞凋亡的作用。BP5通过上调p53和p21以及下调Cyclin E1和CDK2诱导G1期细胞阻滞。同时,BP5通过激活未折叠蛋白应答(UPR)效应分子(IRE1α、ATF6、PERK)和下游信号(XBP-1s、eIF2α、ATF4和CHOP)通路,显著诱导了内质网(ER)应激介导的细胞凋亡途径,促进活性氧生成和细胞内Ca2+浓度升高。此外,BP5增加了促凋亡蛋白Bax的表达,减少了抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,降低了线粒体膜电位(△Ψm),导致线粒体向细胞质释放细胞色素c,从而增强了 caspase-9和caspase-3的活性。此外,实验表明,caspase抑制剂(z-VAD-fmk)能显著拮抗BP5对HCT116细胞的抑制作用以及BP5诱导的细胞凋亡。结论:BP5通过诱导G1期细胞周期阻滞、内质网应激以及线粒体介导的caspase依赖性的凋亡途径,从而抑制结肠癌HCT116细胞生长。第二部分法氏囊五肽和金雀异黄素联合应用的初步研究目的:研究BP5和Gen的联合应用对结肠癌HCT116细胞的作用,并探讨其可能的机制。方法:CCK-8法测定细胞活性。Annexin V-APC/7AAD染色法检测细胞凋亡。单丹磺酰尸胺(MDC)染色法检测细胞自噬。蛋白质印迹分析观察细胞凋亡相关蛋白和自噬相关蛋白。结果:与单用BP5或Gen处理组相比,BP5和Gen联合处理组可通过增加Bax的表达水平,降低Bcl-2的表达水平,提高caspase-3和裂解的caspase-3的活性协同抑制HCT116细胞的生长、诱导细胞凋亡,并通过增加LC3-II和降低p62的表达水平诱导自噬性细胞死亡。结论:BP5和Gen的联合应用可通过诱导HCT116细胞凋亡和自噬显示其协同抗癌作用。第三部分158例大肠癌临床特征回顾性分析目的:探索大肠癌在临床分布、病理特征及诊断和治疗上的临床特点。方法:通过回顾性分析扬州市中医院2016年10月至2018年10月肿瘤科诊断为大肠癌的患者资料158例,将大肠癌分为结肠癌和直肠癌两组,并对两组肠癌患者的性别、年龄、病理大体分型、组织学分类、组织分化程度、临床分期、中医证型、转移情况、治疗方法进行整合分析。结果:1.结直肠癌在性别、病理大体分型、组织学分类、组织分化程度、临床分期、转移情况上差异无统计学意义(P>0.05)。结直肠癌在发病率上均是男性高于女性,结肠癌男性构成比例(62.37%)略低于直肠癌(64.62%)。病理大体分型50%以上为溃疡型,在组织学分类上80%以上为腺癌,少部分为粘液腺癌,其他类型极少,病理分化程度超过半数以上为中分化。结直肠癌中晚期患者所占比例远超过早期患者,单纯淋巴结转移和无转移患者所占比例较高。2.结直肠癌在年龄、中医证型、治疗方法上差异有统计学意义(P<0.05)。在患病年龄上,结直肠癌老年患者多于中青年患者,其中直肠癌中年发病率(33.85%)略高于结肠癌(21.51%),而青年发病率直肠癌(1.54%)却低于结肠癌(10.73%)。结肠癌老年患者所占比例(67.74%)略高于直肠癌(64.61%)。在中医证型方面,结直肠癌患者以痰湿内停证为主,其次为脾气不足证。结肠癌气血两伤证患者比直肠癌多,直肠癌在肝肾阴虚证、瘀毒内结证及脾肾阳虚证上患者数多于结肠癌。结直肠癌在治疗方式上大多以手术+化疗方式,其次是纯手术治疗,但直肠癌手术+化疗+放疗所占比例大于结肠癌。结论:结肠癌和直肠癌在年龄、中医证型、治疗方法上具有明显差异,而在性别、病理大体分型、组织学分类、组织分化程度、临床分期、转移情况上并无明显差异性。