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SupCD28 MAb对Foxp3EGFP小鼠体内表达Foxp3的Treg细胞的扩增作用及对DSS诱导结肠炎小鼠模型的治疗效果的研究背景与目的：CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞(Treg)为一类具有免疫抑制功能的独立的T细胞群,约占外周CD4+T细胞的5%-10%,是机体维持自身免疫耐受的重要组成部分。越来越多的研究证明这群T细胞在免疫病理、移植物耐受、阻止自身免疫反应、肿瘤免疫和维持机体免疫平衡等方面发挥着重要作用。Superagonistic CD28-specific monoclonal antibody (CD28超协单克隆特异性抗体,supCD28 MAb, clone:D665)可以激活T细胞,并且选择性的扩增CD4+Foxp3+ Treg细胞,从而增强其在体内抑制炎症反应,调节自身免疫的作用。已有研究表明CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞在IBD的发病中起着重要的作用,缺乏Treg细胞的小鼠对肠道共生菌群产生高反应性,引起严重的自身免疫性肠炎。而输注Treg细胞可以减轻SCID小鼠由CD4+CD45RBHIGHT细胞所诱导的结肠炎。葡萄糖硫酸钠(Dextran Sodium Sulfate, DSS)诱导的结肠炎类似于人类溃疡性结肠炎,是目前公认的研究IBD的动物模型。本实验研究目的为：(1)通过supCD28 MAb腹腔注射后对Foxp3EGFP小鼠Treg细胞的扩增作用以及对Foxp3,Thl,Th2分化途径相关细胞因子的影响的,以期阐述单次注射supCD28 MAb后不仅在数量上扩增Treg,且通过不同的抗体标记,证明扩增的Treg与体内原有的Treg具有相同的功能。(2)通过supCD28 MAb腹腔注射后对DSS诱导结肠炎小鼠模型的疗效观察,以期为IBD的治疗提供新的实验依据。方法：第一部分：30只Foxp3EGFP小鼠随机分为正常对照组,supCD28 MAb注射1-4组,每组6只。对照组不做处理,supCD28 MAb组给予一次腹腔注射supCD28 MAb1mg/只,1-4组分别于注射后第3天,第7天,第14天,第30天取脾脏,肠系膜淋巴结,胸腺及外周静脉血的淋巴细胞,经抗CD4, CD62L,CD103,CD152染色,于流式细胞仪上进行分析比较各组Treg细胞的变化情况。各组小鼠脾脏取淋巴细胞,提取RNA后,逆转录为cDNA,对Foxp3, IFN-γ,TNF-α,IL-6, IL-10,TGF-β进行实时定量PCR分析,比较各因子的变化情况。第二部分：20只Foxp3EGFP小鼠随机分为空白对照组(n=6)、3.5%DSS组(n=6)、和DSS模型supCD28 MAb给药组(n=8)。空白对照组给予蒸馏水自由饮用,3.5%DSS组和给药组均予3.5%的DSS溶液自由饮用5天,给药组在饮用3.5%DSS第一天给予腹腔注射supCD28 MAb 1mg/只。每日进行疾病活动标准(DAI)评分。第8天处死所有小鼠,取结肠标本测量长度,做HE染色,行结肠病理学评分。模型组和给药组取脾脏,肠系膜淋巴结,淋巴细胞进行抗CD4, CD62L,CD103,CD152染色,于流式细胞仪上进行分析比较两组Treg细胞的变化情况。结肠,脾脏细胞提取RNA后,逆转录为cDNA,对Foxp3, IFN-γ,TNF-α,IL-6, IL-10,TGF-β细胞因子进行实时定量PCR分析,比较各因子的变化情况。结果：第一部分：1.注射supCD28 MAb后第3天,小鼠脾脏、肠系膜淋巴结较对照组有显著增大,而胸腺与对照组相比体积变化不大。小鼠脾脏及肠系膜淋巴结的Foxp3+CD4+Treg细胞增加约3倍,外周血Foxp3+CD4+Treg细胞增加约2倍。胸腺中Foxp3+CD4+Treg细胞在两组中没有显著差异。2.肠系膜淋巴结中Foxp3+CD4+Treg细胞在注射后第3天达到顶峰,随后逐渐下降,至第30天左右可恢复到接近对照组水平。脾脏及外周血中Foxp3+CD4+Treg细胞在注射后第7天达到顶峰,随后逐渐下降,至第30天左右可恢复到接近对照组水平。胸腺细胞中Foxp3+CD4+Treg细胞一直无显著增加或减少。3.脾脏及肠系膜淋巴结中CD4+CD103+Foxp3+ Treg细胞,CD4+CD152+Foxp3+ Treg细胞,CD4+CD62L+Foxp3+ Treg细胞在注射后第三天较对照组均显著增加,倍数约5-10倍。4.实时定量PCR的结果显示：脾脏淋巴细胞中Foxp3的表达较对照组显著增加,注射后第3天达到高峰,约为18.5倍。脾脏淋巴细胞中Th1及Th2途径的细胞因子也有增加,其中以Th2途径中IL-10的增加最为显著,第3天达到151倍。第二部分：1.DSS模型supCD28 MAb给药组小鼠一般情况优于DSS模型组小鼠。全结肠长度8.00±0.44cm长于DSS模型组6.63±0.30cm (p<0.05); DAI评分1.75±0.88显著低于DSS模型组3.41±0.57,且有统计学意义(p<0.05)。病理组织学评分8.50±5.07也显著低于DSS模型组29.00±3.83(p<0.05)。2. supCD28 MAb给药组小鼠在脾脏及肠系膜淋巴结中CD4+CD103+Foxp3+ Treg细胞,CD4+CD152+Foxp3+ Treg细胞,CD4+CD62L+Foxp3+ Treg细胞均高于DSS模型组。3.实时定量PCR的结果显示：抗炎细胞因子Foxp3,IL-10,TGF-β在DSS组小鼠结肠及脾脏的表达都显著减少,但在supCD28 MAb给药组中均有增加。促炎细胞因子IL-6在DSS组小鼠的结肠组织中表达要比supCD28 MAb给药组小鼠显著增高。结论：1.单次腹腔注射supCD28 MAb可以选择性的扩增CD4+Foxp3+ Treg细胞,且扩增Treg与体内原有的Treg细胞具有相同的免疫学功能。2. supCD28 MAb扩增CD4+Foxp3+ Treg细胞后可导致小鼠体内Foxp3,Th1,Th2, Treg途径的细胞因子的变化,其中以大量分泌Foxp3, IL-10为主。3. supCD28 MAb通过增加小鼠体内CD4+Foxp3+ Treg细胞水平可以减轻DSS诱导的结肠炎损伤,其机制可能是通过调节Th1/Th2平衡,以大量分泌IL-10等抗炎因子来发挥作用。