论文部分内容阅读
三角帆蚌是我国特有且重要的大型淡水珍珠蚌。三角帆蚌的育珠周期和产珠的质量决定了三角帆蚌的经济价值。为了更大提高育珠的经济效益,在技术人员和科研人的共同研究下人工培育珍珠的工艺逐渐成熟。本实验室通过将游离细胞与珠核共培育的方法(简称游离细胞培育法)改进了三角帆蚌有核珍珠培育工艺,但如何提高游离细胞的增殖能力,一直是困扰游离细胞培育法工艺发展的关键问题。本研究针对三角帆蚌体外游离细胞培养中细胞增殖问题,对三角帆蚌细胞周期蛋白(cyclin)进行筛选并对其功能进行初步探讨,旨在了解三角帆蚌外套膜细胞的细胞周期(cell cycle)的调控机制。本研究在转录组和数字基因表达谱(DGE)中筛选到10个cyclin基因,通过生物信息学分析及文献支持,确定了4个与细胞分裂最相关的cyclin基因即cyclin A、cyclin B、cyclin D2和cyclin E,并且首次在三角帆蚌中对这4种cyclin基因进行了验证及克隆,克隆得到的cyclin A的CDS区的长度为413 bp,cyclin B基因的cDNA长度为1024 bp,包括ORF为768 bp,3’-UTR 197 bp,,编码255个氨基酸残基,cyclin D2的CDS区长度为368 bp,cyclin E的CDS区长度为391 bp;通过其基因序列相似性分析,该4种cyclin基因均与牡蛎、扇贝等贝类具有同源性;对cyclin A、cyclin B、cyclin D2、cyclin E的氨基酸序列分析,发现前三种cyclin均具有周期蛋白框(cyclin box);通过对cyclin A、cyclin B、cyclin D2、cyclin E的靶蛋白预测,结果表明cyclin A和cyclin B蛋白均与细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)1、2有靶向关系,cyclin D2与CDK6和CDK4在细胞周期调控中具有靶向关系,cyclin E在细胞周期调控中与CDK1、CDK2、CDK4相互作用。综上所述,三角帆蚌中存在cyclin基因,并具有cyclin的结构特点。本研究构建了cyclin A、B、D2、E基因在雌性及雄性三角帆蚌中的组织表达谱,结果发现该4种cyclin基因表达均具有组织特异性。cyclin A、B、E基因在性腺中的表达量显著高于闭壳肌、斧足、外套膜、心脏、血液、内脏团和鳃,并且具有显著雌雄差异(P<0.05),表明上述三种基因的高表达与三角帆蚌生殖细胞成熟及性腺细胞分裂活跃相关;cyclin D2基因在鳃中的表达显著高于其他组织(P<0.05),并无显著的雌雄表达差异(P>0.05),表明其与三角帆蚌鳃细胞增殖分裂速度快相关。三角帆蚌各组织细胞周期时相均呈现S期细胞占比高于G1/G0期和G2/M期细胞占比,而各组织中G1/G0期细胞占比不同,可以表明各组织间的细胞分裂速度不同。本研究应用RNA干扰技术(RNAi)使三角帆蚌中cyclin B及cyclin D2沉默。注射cyclin B干扰片段的三角帆蚌性腺和鳃中cyclin B的表达显著降低,同时流式细胞仪测定其细胞的时相变化,发现G2/M期细胞占比下降从而使处于分裂期的细胞减少,表明cyclin B在三角帆蚌能调控性腺及鳃细胞分裂,cyclin B干扰片段对外套膜中cyclin B无干扰效果,表明cyclin B的小干扰RNA(siRNA)介导的RNAi在三角帆蚌中不具有系统性。cyclin D2干扰片段对三角帆蚌性腺、鳃及外套膜组织均无干扰效果。本研究通过体外培养三角帆蚌外套膜细胞,并在培养24、60、84、108、120 h时检测cyclin B和cyclin D2基因在培养过程中表达变化及细胞周期时相变化情况。实验结果表明随着培养时间的增加,cyclin B和cyclinD2的表达量均显著升高(P<0.05),结合不同细胞培养时间下外套膜细胞周期的时相变化结果,证明这两种cyclin虽然在体外培养的外套膜细胞中能够不断积累及表达,但并未达到能够与CDK结合并激发CDK活性的量,从而无法促使细胞分裂。本研究对三角帆蚌细胞周期蛋白进行了分子及细胞水平上的功能性研究,初步探讨了三角帆蚌细胞周期蛋白的调控机制,为促进外套膜细胞体外分裂提供了新的研究思路,为外套膜细胞体外建系提供理论支持,也为优化育珠工艺、进一步推动我国珍珠产业蓬勃发展奠定了科研基础。