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一、研究背景中国的肝癌发病率居世界最高国家之列,无论是发病例数还是死亡例数均占全球的一半以上。由于我国肝癌患者大多发现迟、分期晚,确诊时约仅20%患者可手术切除,而对于大多数患者来说,现有治疗手段非常有限。尽管索拉非尼一直是晚期、不可切除肝癌的治疗金标准,但其对患者生存时间的改善却很有限。免疫治疗在这种情况下应运而生,为肝癌患者带来了曙光。然而免疫治疗低的反应率以及昂贵的治疗费用使得大部分患者望而却步。为了提高免疫治疗疗效,深入了解肝癌免疫微环境并揭示其形成免疫逃逸的机制迫在眉睫。肠道菌被报道参与了包括肿瘤在内的多种疾病的发生发展,尤其是肝脏特殊的解剖结构决定了其与肠道菌关系更为紧密。深入探讨肠道产物对肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）免疫微环境的影响有利于揭开HCC复杂免疫微环境的面纱。有研究证明脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）可以通过toll样受体4（toll-like receptor 4,TLR4）结合适配器蛋白髓样分化标志物88（adaptor protein myeloid differentiation marker 88,My D88）刺激靶细胞,对免疫应答产生重要影响,既可介导抗肿瘤免疫,也可促进免疫逃逸。但LPS在HCC免疫微环境调控中发挥的作用尚不明了。因此,探讨LPS对HCC免疫微环境的影响及其分子机制可为改善HCC的免疫治疗疗效提供新的方向。长链非编码RNA（long non-coding RNAs,lnc RNAs）是一类长度大于200个核苷酸的非编码蛋白转录本,可参与调控生命发育的各个阶段以及生理病理进程。近年来,不断有研究发现lnc RNA可以通过多种方式参与免疫调控过程,包括肿瘤的免疫抵抗以及免疫逃逸。lnc RNA MIR155HG,又称为B细胞整合集群（B-cell integration cluster,BIC）,被认为在肿瘤发展和免疫调控中发挥着重要功能。但是MIR155HG在肝癌中的作用尚未见报道。因此本研究重点探索了MIR155HG在LPS介导的肝癌免疫逃逸中的作用及其机制。二、研究方法利用GEPIA（The gene expression profiling interactive analysis）和TIMER（Tumor immune estimation resource）在线分析工具分析TCGA（The cancer genome atlas）数据库中MIR155HG在各类肿瘤中的表达以及与预后的关系,并分析MIR155HG的表达与免疫细胞、免疫分子之间的相关性。q RT-PCR检测胆管癌和肝细胞癌临床组织标本中MIR155HG与免疫检查点分子细胞程序性死亡-配体1（programmed cell death 1 ligand 1,PD-L1）和细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（cytotoxic T lymphocyte associated antigen 4,CTLA4）之间的关系。收集未接受术前治疗的肝癌患者血浆样本,利用鲎试剂检测并比较肝癌与肝硬化肝癌患者血浆中LPS的水平。在小鼠体内检测LPS对肝癌组织免疫检查点分子程序性细胞死亡蛋白-1（programmed cell death protein-1,PD-1）和PD-L1的表达的影响。检测LPS刺激对肝癌细胞PD-L1表达的影响,并利用T细胞介导的肿瘤杀伤实验分析活化的T细胞对LPS刺激过的HCC细胞的杀伤作用。随后利用GEPIA2在线工具分析LPS激活的主要分子TLR4和My D88与MIR155HG以及PD-L1之间的相关性关系,寻找LPS调控PD-L1表达机制。在肝癌细胞中研究LPS对MIR155HG以及MIR155HG对PD-L1的调控作用。分析METTL14在LPS诱导MIR155HG表达中的作用,并利用RNA pull down、RIP（RNA binding protein immunoprecipitation,RNA结合蛋白免疫沉淀）、双荧光素酶报告实验等手段研究其机制。Lnc Locator数据库预测并用FISH（fluorescence in situ hybridization,荧光原位杂交）实验验证MIR155HG在肝癌细胞中的亚细胞定位。Star Base 3.0预测与MIR155HG结合的mi RNA以及与该mi RNA结合的靶m RNA,双荧光素酶报告实验检测MIR155HG与mi RNA,mi RNA与靶基因的相互作用。小鼠体内验证MIR155HG对PD-L1的调控作用。并在细胞及小鼠体内研究MIR155HG对HCC生长的影响。最后,在TCGA数据库和临床组织标本以及小鼠体内验证LPS-METTL14-MIR155HG-PD-L1调控轴。三、研究结果1.在多种类型肿瘤中,MIR155HG在肿瘤组织和正常组织中表达有差异,并且与肿瘤的分期及预后有关,MIR155HG在胆管癌、多形性胶质细胞瘤、皮肤黑色素瘤等肿瘤中可以作为预后的指标。2.在包括肝癌在内的绝大多数类型的肿瘤中,MIR155HG与免疫细胞的浸润、免疫分子的表达、尤其是免疫检查点分子PD-1、PD-L1、CTLA4等的表达关系密切。3.TCGA肝癌数据分析发现LPS激活的通路分子TLR4和My D88与MIR155HG和PD-L1之间呈正相关关系。临床HCC患者标本结果显示,肝硬化肝癌患者血浆LPS水平和肿瘤组织PD-L1表达较不伴随肝硬化的肝癌患者高。4.在小鼠体内,腹腔注射LPS上调了肝癌组织PD-1和PD-L1的表达,促进了肿瘤的生长,并且肝癌细胞中敲低MIR155HG抑制PD-L1的表达。5.LPS刺激和过表达MIR155HG均使得肝癌细胞PD-L1的表达上调,并且上调的PD-L1具有抑制T细胞介导的杀伤功能。Rescue实验发现MIR155HG在LPS诱导的PD-L1过程中发挥关键的调控作用。6.LPS通过上调RNA甲基转移酶METTL14促进MIR155HG发生N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine,m6A）修饰,通过m6A-ELAVL1依赖的方式稳定MIR155HG。7.细胞实验结果显示MIR155HG通过ce RNA机制竞争性抑制mi R-223-3p与STAT1 3’UTR的结合从而上调PD-L1的表达。小鼠体内实验证实MIR155HG通过mi R-223-3p/STAT1通路调控PD-L1的表达。8.MIR155HG对肝癌细胞生长以及迁移无显著影响。9.肝癌患者肿瘤组织中PD-L1的表达与LPS通路激活以及METTL14-MIR155HG-PD-L1信号有关。10.肝硬化肝癌患者肿瘤组织METTL14-MIR155HG-STAT1轴上调。四、结论本研究揭示LPS通过影响MIR155HG的m6A修饰上调PD-L1的表达从而引起HCC免疫逃逸,并且肝硬化肝癌患者免疫逃逸微环境的形成可能与高水平的LPS密切有关。当前的研究结果不仅为LPS诱导HCC分子机制提供了新的视角,并且推动了HCC有效的免疫治疗策略的发展。