伪狂犬病毒lncRNA转录组测序和lncRNA在神经细胞中的表达

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长链非编码RNA(Long noncoding RNA,lncRNA)是一类长度大于200 bp且不具有编码功能的转录本。在真核细胞中,长链非编码RNA的主要通过以下几种方式实现其功能:作为诱饵阻止蛋白质和核酸等物质与其相对应的底物结合;作为骨架与其他物质形成相关的复合物;作为向导将相关的物质定位到细胞中特定的位置。通过这些调控方式,长链非编码RNA参与真核生物细胞的复制、生长、分化、凋亡等过程,从而影响生物个体的生长发育、表观遗传、免疫反应和自身相关的疾病。伪狂犬病毒(Psedorabies virus,PRV)是疱疹病毒科α疱疹病毒亚科的成员之一。每年该病毒的感染给世界生猪养殖业造成重大的经济损失。PRV在感染天然宿主时具有噬神经性和潜伏感染性。当PRV在宿主的中枢神经系统中建立潜伏感染时,病毒在基因ep0和ie180之间的DNA序列编码了数条潜伏感染相关的转录本(Latency associated transcripts,LATs),这些潜伏感染相关的转录本都属于lncRNA,且在PRV感染的上皮细胞中部分潜伏感染相关的lncRNA能够以较低的丰度表达。因此,PRV感染上皮细胞时可能编码未知的lncRNA,且这些lncRNA可能在病毒的感染、复制、神经细胞侵入和潜伏感染等过程中发挥重要的功能。大部分lncRNA与真核生物的mRNA结构相似,都具有5′端的帽子结构和3′端的ploy(A)结构,但有部分lncRNA不具有ploy(A)结构。因此,在链特异性文库构建过程中,为了尽量获得病毒编码的各种RNA,我们用随机引物代替oligo-dT对RNA进行反转录。利用高通量测序技术对文库进行测序,同时结合生物信息学方法分析病毒和宿主表达的lncRNA。随后通过northern blot、RT-PCR和3′RACE验证病毒和宿主编码的lncRNA,并且利用序列比对和RT-CR证明PRV编码的lncRNA在不同毒株之间具有保守性。此外,当PRV感染鸡原代背根神经节(Dorsal root ganglion,DRG)细胞时,病毒编码的lncRNA能够在神经细胞中表达。而且病毒感染的时间、感染剂量和细胞的培养方式都能影响PRV编码的lncRNA在神经细胞中的表达。在上皮细胞中,我们利用siRNA干扰病毒lncRNA的表达,结果表明部分lncRNA能够抑制病毒的复制。因此,该研究能够为lncRNA在PRV潜伏感染过程中的功能提供理论基础和新的思路。本研究的主要工作内容如下:1.PRV lncRNA转录组测序及分析PRV以1 MOI的剂量感染PK-15细胞,24 h后提取细胞的总RNA,同时对提取的RNA进行质量检测。随后构建链特异性文库,利用Illumina Hiseq2500测序平台对文库进行测序。随后去掉测序数据中质量较低的数据,通过生物信息学方法分析病毒和宿主编码的lncRNA。我们总共鉴定了28262个lncRNA,其中发现3条病毒编码的lncRNA,其余的28259条lncRNA均为宿主自身编码的lncRNA。在宿主编码的lncRNA中,28224条lncRNA是新发现的lncRNA,剩余的35条lncRNA已经被报道。2.LncRNA的鉴定首先将PRV Ea株病毒感染PK-15细胞,利用RT-PCR分别验证病毒和宿主编码的lncRNA。同时利用RT-PCR验证PRV编码的lncRNA在PRV Bartha株、HNX株和SMX株之间具有保守性。为了进一步验证病毒和宿主编码的lncRNA,我们利用northern blot检测到1条病毒编码的lncRNA以及利用3′RACE获得1条病毒编码的lncRNA的3′末端序列。3.PRV编码的lncRNA在神经细胞中的表达我们选取10日龄的SPF鸡胚分离鸡胚DRG神经细胞,并将细胞分别接种到细胞培养皿和微流体中,细胞培养至一个星期时即可获得成熟的神经细胞。为了验证PRV编码的lncRNA是否能够在神经细胞中表达,我们用PRV Ea株病毒感染细胞培养皿中的成熟的神经细胞,RT-PCR和qPCR结果显示PRV编码的3条lncRNA能够在神经细胞中表达,且病毒感染的时间和剂量能够影响病毒lncRNA的表达。对于培养在微流体中的神经细胞,当神经细胞成熟后,我们向神经细胞的轴突端接种PK-15细胞,构建PRV神经细胞入侵模型和PRV激活感染状态时上皮细胞入侵模型。RT-PCR和qPCR结果表明不同培养方式的细胞能够影响病毒lncRNA的表达。4.PRV编码的lncRNA对病毒复制的影响根据病毒lncRNA的序列,我们分别设计相应的siRNA干扰病毒编码的lncRNA在PK-15细胞中的表达。通过对干扰后的病毒滴度进行分析,发现2条病毒编码的lncRNA被siRNA干扰后显著性地促进病毒的复制。总的来说,我们的研究结果揭示在PRV感染宿主细胞的过程中,病毒自身除了能够编码lncRNA外,同时还能够引起宿主细胞lncRNA的表达。病毒编码的lncRNA在神经细胞中同样具有较高的表达丰度,而且在不同培养方式的神经细胞中,病毒编码的lncRNA的表达量也不同。部分病毒自身编码的lncRNA被siRNA干扰后显著性地促进病毒的复制。
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