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手足口病(Hand foot and mouth disease,HFMD)通常表现为5岁以下儿童常见的发热性发疹性疾病,症状包括:手掌和足底,颊粘膜,舌头和臀部的囊泡,其主要传播病原体是人肠道病毒(Enterovirus71,EV71)。研究表明宿主细胞凋亡与病毒复制之间关系复杂,而已知EV71病毒颗粒感染宿主细胞后诱导凋亡的发生,因此阐明凋亡在EV71病毒复制过程中的作用机制对我们应用凋亡相关药物抗手足口病至关重要。半胱天冬氨酸水解酶(Caspases-3)是参与细胞凋亡的重要因子,而凋亡影响病毒复制主要是通过影响病毒的非结构蛋白实现的。病毒非结构蛋白3C不仅在病毒蛋白的成熟过程中扮演关键角色,研究还表明,EV71通过非结构性病毒蛋白3C激活Caspase-3以诱导宿主细胞凋亡,然而,直到现在还不清楚3C如何激活Caspases以及Caspase激活到底是如何影响病毒的产生的。首先,我们探究了3C和Caspase蛋白激活之间的关系,研究对象为人肝癌细胞Hep G2,通过细胞形态学、核染色研究Hep G2转染3C后引起的细胞病变效应以及Caspase-3抑制剂对Hep G2转染3C保护作用;通过免疫印迹和免疫共沉淀,活力测定检测等生化实验方法检测转染3C和3C突变体时Caspase-3,8,9的激活情况,深入研究3C蛋白与Caspases蛋白的作用机制。其次,我们全面检测了capsase-3抑制剂对宿主细胞感染EV71(MOI为1)后的保护作用,研究对象为人横纹肌瘤细胞RD,设置不同实验处理组:对照组(Mock+Con)、EV71感染组(EV+Con)、抑制剂组(Mock+In)、EV71感染加抑制剂保护组(EV+In),通过细胞流式分析、Elisa、细胞计数、实时定量PCR、TCID50等操作方法观察病毒感染24 h后细胞周期、炎症因子释放、基因表达、病毒的毒力等变化。3C和Caspase蛋白激活之间关系的研究结果显示:Caspase-3抑制剂能抑制3C转染引起的细胞病变效应,同时对细胞DNA片段化也具有保护作用;转染3C能够使Hep G2细胞中的Caspase-3,8,9活性增大同时表达量增多(P<0.001);免疫共沉淀显示3C能够结合Caspase-8,9但不结合Caspase-3;转染3C的细胞中Caspase-8或Caspase-9活性被抑制后,Caspase-3的活性也降低(P<0.001);转染3C突变体相比转染3C Caspase-3,8,9活性降低(P<0.001);免疫沉淀Western Blot显示3C和3C突变体均能结合caspase-8,9但不结合caspase-3。Caspase-3抑制剂对宿主细胞保护作用的研究结果显示:首先,Caspase-3抑制剂保护宿主细胞免受EV71感染引起的凋亡。Western Blot显示与EV+Con组比较,EV+In组Caspase-3活性蛋白量明显降低(P<0.001);与Mock+Con(1.53±0.03×104)比较,EV+Con组细胞数量减少(0.57±0.01×104)(P<0.001),而EV+In组细胞数量明显恢复(1.06±0.06×104);ELISA结果显示与EV+Con组明显增高的炎症因子IL-6的水平相比,EV+In组IL-6水平明显降低(P<0.001);Mod Fit LT分析细胞周期EV+In组反转了EV+Con组的S期阻滞(P<0.001);RT-PCR实验显示感染后2 h(病毒侵入阶段)及12 h(病毒复制)时,EV+Con与EV+In组VP1的基因表达量和5’UTR m RNA水平相关Luciferase活性无差别,但Westrn Blot显示感染后24 h,与EV+Con组比较,EV+In细胞内和上清中的病毒蛋白VP1的量明显降低(P<0.001);采集Caspase-3抑制剂处理后的上清液病毒进行实时PCR分析,结果证实与EV+Con组(1.00±0.39)比较,EV+In组病毒基因组表达水平降至(0.08±0.003)(P<0.001),同时EV+In组TCID50/m L也明显下降。结论:一、EV71编码的非结构蛋白酶3C通过Caspase途径诱导宿主细胞凋亡,3C结合Caspase-8和Caspase-9,但不结合Caspase-3,并且Caspase活化依赖于3C的蛋白水解活性;二、Caspase-3抑制剂能够保护宿主细胞避免3C蛋白引起的细胞凋亡;三、Caspase-3抑制剂可减少EV71感染引起的细胞损伤,通过抑制宿主细胞S期阻滞减少EV71病毒粒子的含量;四、Caspase-3抑制剂不影响EV71的进入、复制和翻译,但可以减少EV71病毒粒子的产生;五、宿主细胞Caspase-3被EV71操控用于病毒本身的繁殖扩增。