体细胞核移植技术是生物工程技术发展中的一个重要的里程碑,该技术在动物育种,生产转基因动物、建立动物模型、提供人造器官、保护珍稀濒危动物及发育生物学的研究等方面发挥重要作用。小鼠作为一种广泛使用的实验模型动物,具有其他生物不可比拟的优势,因此利用小鼠进行体细胞核移植技术的基础研究具有十分重要的理论及现实意义。但是目前小鼠的体细胞核移植效率依然很低,核移植过程中任何一个环节都对整个实验的成败产生重要影响,因此对小鼠体细胞核移植过程的各环节进行优化,对提高核移植成功率具有非常重要的意义。本实验主要从小鼠卵母细胞的孤雌激活、体细胞核移植方法以及小鼠胚胎的输卵管移植三个环节进行研究,旨在初步建立小鼠体细胞核移植体系,提高小鼠体细胞核移植效率,为本实验室的其他哺乳动物的体细胞核移植奠定一定的技术基础。实验一小鼠卵母细胞孤雌激活方法的研究1.实验选用电刺激联合细胞松弛素B(CytochalasinB, CB)的方法对卵龄为18h的B6D2F1小鼠卵母细胞进行激活,探讨电场强度、脉冲宽度、脉冲次数对卵母细胞激活效果的影响,以卵母细胞激活率、激活后培养的卵裂率、囊胚形成率来判断激活效果。实验发现,以2.0kV/cm的电场强度,801μS的脉冲宽度,3个脉冲次数刺激小鼠卵母细胞能够得到较高的激活率(80.1%)、卵裂率(53.6%)及囊胚形成率(23.2%)。2.在电激活最佳激活参数的基础上,与10mmol/LSrCl2+CB激活卵龄为18h的卵母细胞4h的激活结果进行比较。研究发现Sr2+激活的卵母细胞激活率为82.5%、卵裂率为56.1%、囊胚形成率为27.8%,均高于电激活,且激活后的卵母细胞状态较好,后续发育能力较强,得到的卵裂胚胎及囊胚质量较好。因此10mmol/LSrCl2+CB激活卵龄为18h的卵母细胞4h是理想的卵母细胞的孤雌激活方法。实验二小鼠体细胞核移植方法的研究1.去核方法的比较：选用盲吸去核法、蔗糖辅助去核法、Hoechest33342染色去核法,在Piezo介导下分别对MII期卵母细胞进行去核,实验发现蔗糖辅助去核法对卵母细胞进行去核可以得到较高的去核效率(82.7%),高于盲吸法(49.0%)和Hoechest33342染色去核法(80.4%),且该法示核清楚,吸取的细胞质较少,对卵母细胞的损伤较小,操作简便,减少了去核操作时间。因此蔗糖辅助去核法是较好的去核方法。2.细胞松弛素B(CytochalasinB, CB)浓度对去核效果的影响：实验将细胞核清晰可见的卵母细胞放入含有CB浓度分别为5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml的去核操作液中去核,以去核率来检测去核效果。研究发现在CB浓度为10μg/ml时,去核效果较好(去核率：82.7%),显著高于5μg/ml和20μg/ml浓度下的去核率(去核率分别为64.2%、51.3%)。3.重构胚构建方法的比较：本实验以颗粒细胞作为供核细胞,以胞质内注射法、卵周隙注射法两种方法对去核卵母细胞进行注核,比较两种方法的重构胚率、卵裂率。研究发现胞质内注射得到的重构胚率明显高于卵周隙注射(73.6%vs32.3%),且重构胚后续发育能力优于卵周隙注射,因此卵胞质注射优于卵周隙注射。实验三小鼠胚胎输卵管移植技术的建立1.不同胚龄的胚胎对输卵管移植的影响：实验选用B6D2F1小鼠1-细胞胚胎、2-细胞胚胎、8-细胞胚胎进行输卵管移植,比较代孕母鼠妊娠率、产仔率,确定最适合输卵管移植的胚胎发育期。实验表明,植入2-细胞胚胎的代孕母鼠的妊娠率为60.0%、产仔率为29.0%,显著高于1-细胞胚胎(妊娠率：33.3%；产仔率：13.6%)和8-细胞胚胎(妊娠率：20.0%；产仔率：7.3%)。2.两种输卵管移植部位的比较：实验用2-细胞胚胎分别进行输卵管伞开口处移植和输卵管壁切口移植,研究发现通过输卵管壁切口移植的代孕母鼠的妊娠率和产仔率高于输卵管伞部移植(60.0%vs53.3%、29.0%vs26.3%),且前者方法简便,对输卵管损伤较小,是较为理想的胚胎移植方法。综上所述,用2-细胞胚胎对代孕母鼠进行输卵管壁切口移植,是理想的输卵管移植方法。