玉米小斑病（Southern corn leaf blight）是世界玉米生产上的重要病害之一,其病原无性态为玉蜀黍平脐蠕孢菌（Bipolaris maydis）,有性态为异旋孢腔菌（Cochliobolus heterostrophus）。病原菌具有寄主适应性强,生理分化明显,遗传多样性丰富等特点。有性生殖是病菌发生变异的重要途径之一,通过有性生殖发生的基因重组,不仅能丰富病原菌的遗传多样性,还能产生致病性更强的菌株,但有性生殖在小斑病菌遗传多样性形成中的作用尚不清楚。本研究主要以四川玉米小斑病菌为对象,在明确自然群体遗传多样性的基础上,开展病菌群体的交配型检测和育性分析,评估有性生殖的发生概率;构建基于交配型基因的系统发育树,明确交配型基因在小斑病菌及其近似种属系统发育研究中的作用;利用荧光染料对有性世代的结构进行观察,并对影响有性世代发育的诱导条件进行优化,以获得高成活率的子囊孢子;在此基础上,选择高配合力菌株进行杂交组合,构建有性生殖子代群体,比较子代与亲代的遗传差异,分析有性生殖在病菌遗传多样性形成中的作用,为揭示玉米小斑病菌变异机制及预测小斑病菌群体演化规律奠定基础。主要结果如下:1.2012～2018年,在四川、云南等地133个采样点共获得玉米小斑病菌单孢菌株697株,各菌株在菌落形态、生长速率、产孢量等培养性状上表现出丰富的多样性。其中84.07%的菌株在PDA培养基上平均生长速率超过6.00 mm/d,52.22%的菌株平均产孢量达到6×104个/cm2,表现出较强的菌丝生长能力和产孢能力。通过构建基于核糖体DNA内转录间隔区（r DNA-ITS）和三磷酸甘油醛脱氢酶基因（GAPDH）序列的系统发育树,能够有效地揭示小斑病菌在平脐蠕孢属中的分类地位。致病性测定表明,小斑病菌群体中存在明显的致病性分化,其中强致病力菌株为优势类型。运用筛选的9个ISSR引物共获得93个清晰、稳定的扩增位点,多态性频率为93.55%,表明小斑病菌存在丰富的DNA多态性。病菌的总遗传多样性为0.1929,种群内遗传多样性为0.1528,种群遗传分化系数为0.1799,表明遗传变异主要源于群体内部。在相似系数为0.79处可将211个小斑病菌菌株分为5个类群,初步分析表明小斑病菌的遗传聚类与地理来源存在一定的相关性。2.对引起玉米叶斑病的46株蠕孢菌菌株的交配型基因（MAT1-1和MAT1-2）、r DNA-ITS、GAPDH、黑色素还原酶基因（Brn1）和翻译延长因子基因（TEF-1α）序列进行测定,并联合Gen Bank数据库下载的其他蠕孢菌相关序列进行单基因和多基因系统发育分析。结果表明,构建的单基因和多基因系统发育树均能将蠕孢菌中Bipolaris,Curvularia,Exserohilum和Drechslera属有序的聚类,表明基于交配型基因的系统发育分析能够有效区分平脐蠕孢属及其近似的蠕孢菌各属的亲缘关系,交配型基因可以应用于蠕孢菌的系统发育学研究。3.利用荧光染料对小斑病菌有性世代的细胞壁、细胞核和脂质进行染色。荧光显微镜下子囊孢子被染成清晰可辨的亮蓝色,成熟的子囊孢子含有59～91个细胞核,每个细胞含有4～11个细胞核,同时子囊孢子被染成橘红色,表明子囊孢子内储藏大量的脂质物质。子囊孢子悬浮液接种玉米离体叶段,接种2～6h,子囊孢子开始萌发,形成芽管;接种12～24h,大量形成附着胞,每个孢子萌发产生4～7个附着胞;接种后24h,大量形成侵入菌丝,并穿透细胞壁进入相邻细胞;接种后48h,离体叶段出现明显症状,表明小斑病菌子囊孢子同分生孢子一样具有侵染力。小斑病菌有性世代诱导的最佳方法为以Sach’s培养基为基础培养基,玉米叶片为诱导基物,外源添加0.02g/L生物素和0.06g/L Fe Cl3,p H值5～7,24℃下黑暗培养,此时假囊壳及子囊的产生均为最佳。4.采用PCR检测的方法对544株玉米小斑病菌的交配型进行鉴定,其中MAT1-1菌株286株,MAT1-2菌株258株,两种交配型的比例符合1:1的分离比（χ2=1.441,p=0.230）。两种交配型的菌株在各采样区均有分布,但频率稍有不同。筛选一对亲和性高的菌株作为标准菌株,对544株小斑病菌的育性进行测定,其中能够产生子囊孢子的可育菌株483株,占比88.79%。菌株间存在育性的分化,高育性、中等育性、低育性和不育菌株分别占比12.32%、27.39%、49.08%和11.21%。不同地理来源的菌株育性结构不同,菌株育性水平可能与地理来源有关。5.根据育性分析结果,选取配合力较高的6对亲本菌株进行有性杂交,通过单子囊孢子分离的方法构建有性生殖F1代、F2代菌株群体,共获得的F1代菌株264株、F2代菌株180株。444个子代菌株中,MAT1-1菌株214株,MAT1-2菌株230株,两种交配型比例为1.07:1,卡方检验符合1:1分布（χ2=0.071,P=0.789）。F1代和F2代菌株交配型组成一致,表明交配型基因能够稳定遗传。育性测定结果表明,子代菌株较亲本出现了育性分化,可育菌株率为78.60%,高育性、中等育性、低育性和不育菌株分别占比1.13%、25.23%、52.25%和21.40%。F1代和F2代菌株育性结构差异不大,均表现出育性降低的趋势。对子代菌株的生长速率、产孢量、致病性等进行测定,结果表明子代菌株较亲本产生了明显的分化,部分菌株表现出菌丝生长能力、产孢能力和致病性增强的现象,表明有性生殖是导致小斑病菌发生变异的因素之一。综上,玉米小斑病菌自然群体存在丰富的遗传多样性,两种交配型均衡分布且多数为可育菌株。室内诱导能够获得大量的有性子代,且子代群体表现丰富的遗传变异。尽管在自然界中很难发现小斑病菌的有性世代,但隐秘的有性生殖可能正在发生,并在小斑病菌遗传变异中起着重要作用。