第一部分:中国十城市居民吸烟对甲状腺功能影响的研究甲状腺影响机体新陈代谢和生长发育,甲状腺功能异常对普通人群具有显著影响,是一项严重的社会健康问题,现已成为内分泌领域的第二大疾病。本研究利用中国十城市社区居民甲状腺功能流行病学调查数据,重点研究吸烟与血清甲状腺激素浓度的关系以及吸烟与尿碘关系,探讨吸烟与促甲状腺激素(thyroid-stimulating hormone,TSH)、抗甲状腺过氧化物酶抗体(thyroid peroxidase antibody,TPOAb)、抗甲状腺球蛋白抗体(thyroglobulin antibody,TGAb)及尿碘浓度(urinary iodine concentration,UIC)的之间的定量关系。研究目的1.描述中国城市居民血清TSH、TPOAb、TGAb等甲状腺相关激素的水平及UIC水平。2.定量分析吸烟与城市居民血清TSH、TPOAb、TGAb和UIC的关系。研究方法以中国十城市沈阳、北京、济南、西安、南京、上海、武汉、成都、贵阳和广州为调查现场。按照多阶段随机抽样的原则,在全国十个城市的社区随机抽取样本,调查对象为≥20岁,近年不会动迁的常住居民。采用横断面研究的方法于2009年3月～2010年10月对调查对象进行面对面访谈和现场集中调查。调查对象接受问卷调查(主要包括人口特征、碘的消耗情况和吸烟状况等)、体格检查、甲状腺超声检查、样品采集等,并在实验室检测了 TSH、TPOAb、TGAb及UIC水平。不同吸烟状况血清TSH、TPOAb、TGAb与UIC浓度的比较采用Kruskal-Wallis秩和检验和近似t检验。对血清TSH、TPOAb、TGAb与UIC浓度影响因素的分析采用多重线性回归。研究结果1.碘适量地区共调查7784人(占57.4%),碘超足量地区共调查5768人(占42.6%),贵州城市调查的人数最多,比例达到11.0%,沈阳城市调查的人数最少(5.5%)。2.调查对象血清TSH平均水平为3.25±4.83 mU/L,血清TPOAb平均水平为39.18±108.51 U/ml,血清 TGAb 平均水平为 91.89±356.59 U/ml,血清 FT3 平均水平5.02±2.43 pmol/L,血清FT4平均水平16.62±5.15 pmol/L,尿碘中位数平均为238.59±150.25μg/L。3.不同吸烟行为TSH、TPOAb、TGAb和UIC浓度存在明显的统计学差异(P<0.05),经常吸烟者的血清TSH浓度水平最低(2.73±3.78 mU/L),经常吸烟者的血清TPOAb浓度水平最低(26.71±82.42 U/ml),经常吸烟者的血清TGAb浓度水平最低(47.69±263.73 U/ml),经常吸烟者的UIC水平最高(249.02±149.16μg/L)。是否暴露二手烟研究对象的TSH、TPOAb、TGAb无统计学差异(P>0.05),暴露二手烟的调查对象UIC平均浓度明显高于非暴露者(P<0.05)。4.性别、碘情况、年龄、甲状腺疾病家族史、人均月收入和主动吸烟与血清TSH水平有明显的关系(P<0.05),吸烟可以导致血清TSH浓度下降(β=-0.137)。5.性别、主动吸烟、甲状腺疾病家族史、年龄、碘情况、服海带紫菜情况、盐来源与血清TPOAb水平有明显的关系(P<0.05),吸烟可以导致血清TPOAb浓度下降(β=-8.018)。6.性别、甲状腺疾病家族史、年龄、主动吸烟与血清TGAb水平有明显的关系(P<0.05),吸烟可以导致血清TGAb浓度下降(β=-53.214)。7.碘适量地区,年龄、性别、文化程度、服海带紫菜情况、人均月收入、BMI与UIC水平有明显的关系(P<0.05);碘超足量地区,年龄、服海带紫菜情况、人均月收入、主动吸烟、盐来源、BMI与UIC水平有明显的关系(P<0.05);吸烟可以导致碘超足量地区人群UIC水平上升(β=5.145)。研究结论1.中国十城市居民主动吸烟者比不吸烟者血清中的TSH、TPOAb和TGAb浓度低,而UIC水平高;被动吸烟者的UIC水平相对非暴露者较高。2.吸烟作为一项重要的环境因素,吸烟对甲状腺功能的调节起一定作用。第二部分:DPP4在甲状腺乳头状癌发病中的作用及临床意义研究目的桥本甲状腺炎(Hashimoto’s thyroiditis,HT)和甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma,PTC)作为两种常见的结节性甲状腺疾病,其相互关系一直被广大研究者所关注。CD26又称二肽基肽酶4(dipeptidyl peptidase4,DPP4),是参与糖代谢中的重要分子,既可以通过其酶活性调节细胞因子的表达水平,也可以作为蛋白受体发挥生理功能,由于其在血液和体液中有很强的稳定性与可溶性,使其有可能成为一种很好的血清标志物。本文探讨DPP4在HT和PTC发病中的作用和临床意义,通过明确DPP4在HT和PTC患者中的表达,明确DPP4作为HT和PTC鉴别诊断指标,探讨DPP4诱导T细胞分化的作用机制,加深对PTC发病机理的理解,为DPP4作为甲状腺结节良恶性鉴别诊断的生物标记或治疗靶点提供理论依据。研究方法下载甲状腺肿物基因芯片数据集(GPL8300,Series GSE29315),利用R语言克隆分析包对其中的各6例HT与PTC患者甲状腺组织进行表达谱聚类分析。收集了191例甲状腺结节患者分为HT组、PTC组和良性结节组,进行临床病理资料比较,血清和组织标本采用qPCR与western分别检测DPP4在基因和蛋白水平的表达。ELISA检测血清DPP4浓度和DPP4酶活性,免疫组化法检测CD26在组织中的表达,免疫分选技术分选CD3+T细胞和CD4+CD25+T细胞,流式细胞术分析组织细胞亚群比例和CD8+T细胞膜表面GLUT1的表达,siRNA干扰及过表达技术评估DPP4酶活性对T细胞效应功能的影响。数据使用均值±标准差。t检验来比较两组独立数据,使用方差分析、Welch法或H检验进行多组定量资料的比较;使用秩相关进行变量间相关性分析,卡方检验或Fisher确切概率法用来比较分类数据。研究结果1.甲状腺癌乳头状患者的组织中高表达DPP4(1)对HT和PTC患者的甲状腺结节基因芯片进行聚类分析,发现了在PTC中高表达的蛋白分子DPP4。(2)对HT以及PTC患者差异基因进行GO富集分析,发现与HT患者相比,PTC的患者在生物学过程方面上调了细胞增殖调控、细胞迁移、细胞信号转导、上皮细胞分化、系统发育以及组织分化等相关功能基因表达。下调了免疫系统发育、免疫效应功能、白细胞活化调控、细胞表面受体信号通路、保护反应、阳性调控免疫系统过程等相关基因表达。(3)对HT以及PTC患者差异基因进行KEGG富集分析,发现与HT患者相比,PTC患者上调最明显的信号通路分别是:肿瘤转录失调、细胞粘附分子、肿瘤信号通路和肿瘤蛋白聚糖等。下调的信号通路集中在白细胞跨内皮迁移、T细胞受体信号通路、固有免疫防御、细胞因子信号通路、NK细胞介导的细胞毒作用和NF-κB信号通路。2 DPP4具有较好的PTC诊断效能(1)PTC患者组血清DPP4浓度为544.28±284.96 ng/ml,显著高于HT患者组418.57±215.73 ng/ml和甲状腺结节患者组410.64±263.78 ng/ml,与两组相比均有统计学意义(P<0.05)。(2)PTC患者组血清DPP4酶活性为11.57±0.49μg/ml,显著高于HT患者组10.35±0.99μg/ml和甲状腺结节患者组10.65±1.18μg/ml,与两组相比均有统计学意义(P<0.05)。(3)分析入组患者临床病理资料的相关性,取与HT诊断最相关的TPOAb、TGAb,与PTC相关的TSH以及DPP4、DPP4酶活性进行相关性检验,发现血清TPOAb与TGAb浓度正相关(r=0.65,P<0.05),血清DPP4浓度与DPP4酶活性正相关(J=0.281,P<0.05)。(4)血清 DPP4 诊断 PTC 的 ROC 曲线下面积为 0.632(95%CI:0.530-0.733),DPP4 酶诊断 PTC 的 ROC 曲线下面积为 0.707(95%CI:0.610-0.803),DPP4 酶活性作为诊断PTC价值高于DPP4血清浓度。血清DPP4浓度≥409.78 ng/ml可用于辅助诊断PTC(灵敏度=0.625,特异度=0.727),血清DPP4酶活性≥10.84μg/ml可用于辅助诊断PTC(灵敏度=0.781,特异度=0.673)。血清DPP4、DPP4酶活性具有较好的HT和PTC鉴别诊断价值。3.DPP4通过诱导调节性T细胞(regulatory T cells,Treg)的产生和诱导效应T细胞耗竭参与PTC的发生(1)在甲状腺正常细胞株Nthy-ori-3-1细胞中DPP4低表达,甲状腺乳头状癌细胞系BCPAP和TPC1高表达DPP4,重组人促甲状腺素可以诱导正常甲状腺滤泡上皮细胞 Nthy-ori-3-1 表达 DPP4。(2)单纯甲状腺结节与PTC患者结节组织中,DPP4主要定位于甲状腺上皮细胞的胞浆、胞膜特别是腔缘面。PTC患者组织中DPP4的表达阳性率显著高于单纯甲状腺结节患者组织(P<0.05),PTC患者癌组织高表达DPP4,同一切片中的癌旁组织几乎不表达。(3)PTC肿瘤结节组织与单纯结节组织比较,Treg浸润比例较高(P<0.05);建立DPP4高表达甲状腺细胞滤泡上皮细胞稳转株Nthy-ori-3-1与CD4+CD25+T细胞共孵育,发现DPP4高表达甲状腺细胞能够更有效的诱导Treg细胞的产生(P<0.05)。干扰了甲状腺乳头状癌细胞系TPC1细胞中DPP4的表达,在与CD4+CD25+T细胞共孵育体系中,发现DPP4表达下调会抑制TPC1细胞诱导Treg的产生(P<0.05)。(4)DPP4抑制剂K579能够增强中CD8+T细胞表面葡萄糖转运蛋白(Glucose transporter type 1,GLUT1)荧光强度(P<0.05)。研究结论1.PTC患者甲状腺肿物中高表达的蛋白分子DPP4,PTC的患者上调了细胞增殖调控、细胞迁移和上皮细胞分化等恶性行为相关的功能基因表达,下调了免疫系统发育、免疫效应功能和白细胞活化调控等免疫活化相关基因的表达。2.血清DPP4、DPP4酶活性具有较好的HT和PTC鉴别诊断价值,为DPP4作为甲状腺结节良恶性鉴别诊断的生物标记或治疗靶点提供理论依据。3.DPP4可能通过诱导Treg的产生和诱导效应T细胞耗竭介导了 PTC的发生。