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α-半乳糖苷酶是一种广泛存在于自然界中的糖苷水解酶,根据氨基酸序列的同源性将不同来源的α-半乳糖苷酶分为糖苷水解酶(GH)的4、27、36、57和110家族,这5个家族的α-半乳糖苷酶均能催化水解含有α-连接的末端非还原性D-半乳糖的低聚多糖、脂多糖和多聚糖。其中,一部分α-半乳糖苷酶不仅具有水解活性还具有糖基转移活性,使其在饲料、食品、化工、制糖和医药领域的应用前景备受关注。目前,尚未有来源于Mesorhizobium sp.和Pontibacter sp.的α-半乳糖苷酶的报道,也未有文献显示GH27家族α-半乳糖苷酶具有转糖基活性,而微生物来源具有双最适pH的碱性α-半乳糖苷酶的报道也极少。基于α-半乳糖苷酶的应用价值,本研究选择将分别来源于Mesorhizobium sp.、Streptomyces sp.和Pontibacter sp.的3个酶编码基因agaAJB07、agaAHJG4和agaAHJ8连接到pEASY-E2载体上,得到重组质粒,并将构建好的重组质粒转化到Escherichia coli BL21(DE3)中进行表达。利用C端的组氨酸标签对表达获得的重组GH36家族α-半乳糖苷酶AgaAJB07、AgaAHJG4和重组GH27家族α-半乳糖苷酶AgaAHJ8进行纯化,并对纯化酶进行了酶学特性研究,结果表明:(1)重组酶AgaAJB07最适pH为6.5,在pH 7.0–9.0的范围内具有良好的稳定性;最适温度为45℃,50℃时的热稳定性良好;对蛋白酶K和胰蛋白酶具有一定抗性;0.5mmol/L的ZnSO4和30mmol/L的PbAc对该酶具有最大促进作用,可分别提高酶活约0.4倍和10.4倍。该酶在水产动物养殖中具有一定的应用潜力,且能为抗Zn2+和Pb2+机制的研究提供良好的模型材料。(2)重组酶AgaAHJG4的最适pH为双峰,分别为8.0和9.5,在pH 7.5–10.0范围内具有较好的稳定性;最适温度为35℃,在10℃和20℃时分别具有19.3%和35.3%的酶活,热稳定性较差。由于种子吸胀萌发过程中碱性α-半乳糖苷酶活性与种子脱水耐性有潜在关系,因此该酶在改善种子脱水耐性方面有一定潜在价值。(3)重组酶AgaAHJ8的最适pH为5.5,在pH 4.0–8.0范围内具有较好的稳定性;该酶最适温度为50℃,热稳定性差,具有良好的NaCl、Zn2+和Pb2+抗性。该重组酶在耐盐、耐Zn2+和耐Pb2+机制研究方面具有一定的理论价值,在饲料和食品领域中也具有潜在的应用前景。(4)TLC和质谱检测结果表明AgaAJB07、AgaAHJG4和AgaAHJ8均有转糖基活性,以pNPG为半乳糖基供体,AgaAJB07的糖基受体为葡萄糖、半乳糖、木糖、甘露糖、果糖、山梨糖、乳糖、乙醇、异丙醇、甘油、山梨醇、甘露醇;AgaAHJG4的糖基受体为半乳糖、果糖、乳糖、蔗糖、水苏糖、棉子糖;AgaAHJ8的糖基受体为蔗糖、棉子糖和异戊醇。以底物自身做供体和受体时AgaAJB07对p NPG和蜜二糖具有活性;AgaAHJG4对pNPG、水苏糖和蜜二糖具有活性。综上,本研究获得了具有新型酶学特性的2个GH36家族和1个GH27家族α-半乳糖苷酶。其中Mesorhizobium sp.来源的α-半乳糖苷酶AgaAJB07具有酶活性能被高浓度Zn2+和Pb2+促进和转糖基受体多样的特性;Streptomyces sp.来源的α-半乳糖苷酶AgaAHJG4具有碱性双pH和低温活性的特性;Pontibacter sp.来源的α-半乳糖苷酶AgaAHJ8(GH27)具有耐Zn2+、耐Pb2+、耐Na+和转糖基活性的特性。它们不仅为α-半乳糖苷酶的相关活性机理研究提供了有价值的素材,还在食品、水产饲料等领域中具有一定的开发应。