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卵母细胞冷冻保存对于保护雌性动物遗传物质至关重要，同时，它在人类辅助生殖、濒危动物保种和胚胎工程等方面发挥着不可或缺的作用。虽然利用冷冻卵丘卵母细胞复合体（COCs）已经在很多物种获得了健康的后代，但是冷冻后卵母细胞的成活率仍然很低，在很大程度上限制了这项技术的推广应用。为提高玻璃化冷冻效率，我们采取比液氮(-196℃)温度更低的液氦(-269℃)作为冷源，期望通过更换冷源和提高冷冻速率获得冷冻效果的突破。前期研究结果表明：液氦可以代替液氮作为冷源进行卵母细胞冷冻保存，同时将冷源由液氮更换为液氦，不但可以提高冷冻速率，而且可以适当降低冷冻保护剂浓度，从而提高了冷冻效果；与液氮相比，液氦玻璃化冷冻对牛未成熟卵母细胞超微结构和细胞骨架造成的损伤相对较小；玻璃化冷冻影响了部分基因的表达量（ GDF9、BAX、ZAR1、Eg5、P53、CDC20、NPM2 ）。用qRT-PCR测定关键基因mRNA表达量的变化是研究冷冻损伤的一种有效方法，但是，这种用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术逐一筛选差异表达基因（ differentially expressed genes ， DEGs ）的方法，难免会遗漏关键基因，不能全面反映液氦玻璃化冷冻和CPAs这两个关键因素对基因表达造成的影响。目前，RNA测序（RNA sequencing, RNA-Seq）技术非常成熟，能大规模的对样品RNA进行测序分析，筛选出样品中所有的差异表达基因。随着研究的深入，用高通量测序技术进一步研究液氦玻璃化冷冻和冷冻保护剂浓度对牛未成熟卵母细胞mRNA转录组的影响已经变得非常有必要，这样可以从mRNA转录水平上更全面的分析液氦玻璃化冷冻和冷冻保护剂浓度对mRNA转录组的影响，筛选出与冷冻损伤和冷冻保护剂损伤相关的差异基因，为下一步的冷冻调控和方法改进提供依据和线索。
鉴于上述，本研究用牛的未成熟卵母细胞作为实验材料，用转录组测序技术探索液氦冷冻保存对牛未成熟卵母细胞mRNA转录组的影响，同时从全基因转录这一角度对比液氦、液氮、5.6 M和6.6 M冷冻保护剂浓度对牛未成熟卵母细胞基因表达的影响。
实验1：液氦冻存及不同保护剂浓度对牛未成熟卵母细胞体外发育潜力的影响。实验设计五个组，每组设置六个重复：（1）对照组（control），未经冷冻的新鲜卵母细胞；（ 2 ）液氦为冷源冷冻保护液浓度为 5.6 M组（ LHe 5.6 M组）；（3）液氦为冷源冷冻保护液浓度为6.6 M组（LHe 6.6 M组）；（4）液氮为冷源冷冻保护液浓度为5.6 M组（LN 5.6 M组）；（5）液氮为冷源冷冻保护液浓度为6.6 M组（LN 6.6 M组）。四个处理组的卵母细胞在冷冻复苏后和新鲜卵母细胞分别进行体外成熟、体外受精和体外胚胎培养，然后统计各自的形态正常数、成熟数、卵裂数和囊胚数，计算出各自的比率，最后用SPSS软件进行数据统计分析。结果：LHe 5.6 M组卵母细胞的形态正常率、成熟率、卵裂率和囊胚率均高于LN 5.6 M组（ p＜0.05 ）和LN 6.6 M组（ p＜0.05 ）；LHe 6.6 M组的上述各指标均高于LN 5.6 M组（p＜0.05）；LHe 6.6 M组的囊胚率稍高于LN 6.6 M组，但差异并不显著；对照组的各项指标均高于四个处理组，且差异极显著（p<0.01）；而LHe 5.6 M与LHe 6.6 M两个组的各项指标差异均不显著（p＞0.05）。结论：液氦冷冻保存能明显提高冻存后未成熟卵母细胞的发育能力；冷冻温度降低，可以适当降低冷冻保护剂浓度。
实验二：用转录组测序技术探索液氦对牛未成熟卵母细胞基因表达的影响。本实验设计五个组，每组设计三个生物学重复，每个重复20个体外成熟卵母细胞：（1）对照组（control）；（2）LHe 5.6 M组；（3）LHe 6.6 M组；（4） LN 5.6 M组；（5）LN 6.6 M组。四个处理组的卵母细胞冻融后和对照组的卵母细胞共同进行体外成熟培养，用透明质酸酶完全剔除周围的颗粒细胞，然后对15个样品分别进行文库构建，测序和数据分析。用Smart-seq4对十五个样品的mRNA转录组进行分析，然后用edgeR进行基因差异表达分析（ p≤0.05, fold-change≥2）。结果显示：五个组检测到的基因数目在10943到13295之间。与对照组相比：LHe 5.6 M组中发现505个差异表达基因，其中342个基因表达上调， 163个基因表达下调；LHe 6.6 M组中检测到609个差异表达基因，其中493个基因表达上调，116个基因表达下调；LN 5.6 M组中有218个差异表达基因，其中101个基因表达上调，117个基因表达下调；LN 6.6 M组中有221个差异表达基因，其中有104个基因表达上调，117个基因表达下调。通过GO聚类分析，这些差异基因大部分集中在结合、细胞进程、细胞、细胞组分、代谢过程、细胞器、单生物过程、生物调控、生物进程和膜的调控等功能分类。结论：玻璃化冷冻在一定程度上对牛未成熟卵母细胞mRNA转录造成影响，而液氦玻璃化冷冻主要导致差异基因上调；当用液氦作为冷源进行玻璃化冷冻时，降低冷冻保护剂浓度可以降低对牛未成熟卵母细胞基因表达的影响；液氦玻璃化冷冻导致DERA基因明显上调，而该基因的上调对细胞的抗冷冻应急和体外恢复可能有促进作用；Fis1的上调会促进线粒体的膨胀和破碎；所有与卵母细胞紧密相关的差异基因中，可能与冷冻温度有关的基因有 ND2、MPV17L2、PIF1、LPIN1、IMP3、BRD1、DCTN3、DERA、ATP7B、NEK5、HVCN1 和MARK2，可能与渗透压有关的基因有CC2D2A，可能受冷冻温度和渗透压双重影响的基因有PGK1、SLC7A3、FITM2、NPM3、ISCU、CWC15和PSAP。
鉴于上述，本研究用牛的未成熟卵母细胞作为实验材料，用转录组测序技术探索液氦冷冻保存对牛未成熟卵母细胞mRNA转录组的影响，同时从全基因转录这一角度对比液氦、液氮、5.6 M和6.6 M冷冻保护剂浓度对牛未成熟卵母细胞基因表达的影响。
实验1：液氦冻存及不同保护剂浓度对牛未成熟卵母细胞体外发育潜力的影响。实验设计五个组，每组设置六个重复：（1）对照组（control），未经冷冻的新鲜卵母细胞；（ 2 ）液氦为冷源冷冻保护液浓度为 5.6 M组（ LHe 5.6 M组）；（3）液氦为冷源冷冻保护液浓度为6.6 M组（LHe 6.6 M组）；（4）液氮为冷源冷冻保护液浓度为5.6 M组（LN 5.6 M组）；（5）液氮为冷源冷冻保护液浓度为6.6 M组（LN 6.6 M组）。四个处理组的卵母细胞在冷冻复苏后和新鲜卵母细胞分别进行体外成熟、体外受精和体外胚胎培养，然后统计各自的形态正常数、成熟数、卵裂数和囊胚数，计算出各自的比率，最后用SPSS软件进行数据统计分析。结果：LHe 5.6 M组卵母细胞的形态正常率、成熟率、卵裂率和囊胚率均高于LN 5.6 M组（ p＜0.05 ）和LN 6.6 M组（ p＜0.05 ）；LHe 6.6 M组的上述各指标均高于LN 5.6 M组（p＜0.05）；LHe 6.6 M组的囊胚率稍高于LN 6.6 M组，但差异并不显著；对照组的各项指标均高于四个处理组，且差异极显著（p<0.01）；而LHe 5.6 M与LHe 6.6 M两个组的各项指标差异均不显著（p＞0.05）。结论：液氦冷冻保存能明显提高冻存后未成熟卵母细胞的发育能力；冷冻温度降低，可以适当降低冷冻保护剂浓度。
实验二：用转录组测序技术探索液氦对牛未成熟卵母细胞基因表达的影响。本实验设计五个组，每组设计三个生物学重复，每个重复20个体外成熟卵母细胞：（1）对照组（control）；（2）LHe 5.6 M组；（3）LHe 6.6 M组；（4） LN 5.6 M组；（5）LN 6.6 M组。四个处理组的卵母细胞冻融后和对照组的卵母细胞共同进行体外成熟培养，用透明质酸酶完全剔除周围的颗粒细胞，然后对15个样品分别进行文库构建，测序和数据分析。用Smart-seq4对十五个样品的mRNA转录组进行分析，然后用edgeR进行基因差异表达分析（ p≤0.05, fold-change≥2）。结果显示：五个组检测到的基因数目在10943到13295之间。与对照组相比：LHe 5.6 M组中发现505个差异表达基因，其中342个基因表达上调， 163个基因表达下调；LHe 6.6 M组中检测到609个差异表达基因，其中493个基因表达上调，116个基因表达下调；LN 5.6 M组中有218个差异表达基因，其中101个基因表达上调，117个基因表达下调；LN 6.6 M组中有221个差异表达基因，其中有104个基因表达上调，117个基因表达下调。通过GO聚类分析，这些差异基因大部分集中在结合、细胞进程、细胞、细胞组分、代谢过程、细胞器、单生物过程、生物调控、生物进程和膜的调控等功能分类。结论：玻璃化冷冻在一定程度上对牛未成熟卵母细胞mRNA转录造成影响，而液氦玻璃化冷冻主要导致差异基因上调；当用液氦作为冷源进行玻璃化冷冻时，降低冷冻保护剂浓度可以降低对牛未成熟卵母细胞基因表达的影响；液氦玻璃化冷冻导致DERA基因明显上调，而该基因的上调对细胞的抗冷冻应急和体外恢复可能有促进作用；Fis1的上调会促进线粒体的膨胀和破碎；所有与卵母细胞紧密相关的差异基因中，可能与冷冻温度有关的基因有 ND2、MPV17L2、PIF1、LPIN1、IMP3、BRD1、DCTN3、DERA、ATP7B、NEK5、HVCN1 和MARK2，可能与渗透压有关的基因有CC2D2A，可能受冷冻温度和渗透压双重影响的基因有PGK1、SLC7A3、FITM2、NPM3、ISCU、CWC15和PSAP。