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双酰胺类杀虫剂是作用于昆虫肌肉细胞鱼尼丁受体的一类杀虫剂,能有效防治鳞翅目害虫,目前已广泛推广到世界各地。2013年氯虫苯甲酰胺全球销量大于12亿美元,约占杀虫剂销售总量的8%,2014年氯虫苯甲酰胺在杀虫剂销售量排行榜居榜首。随着使用量增加,其对环境风险也提高,目前缺乏双酰胺类杀虫剂对斑马鱼胚胎毒性评价,仅见双酰胺类对斑马鱼急性毒性报道,其胚胎毒性及机理尚不清楚。本论文以斑马鱼胚胎为试验材料,评价氯虫苯甲酰胺(chlorantraniliprole)和溴氰虫酰胺(cyantraniliprole)两种双酰胺类杀虫剂对斑马鱼胚胎的毒性。利用吖啶橙、TUNEL染色,并结合RT-qPCR技术,研究氯虫苯甲酰胺的3个剂型对斑马鱼胚胎发育毒性及诱导斑马鱼胚胎细胞凋亡的毒性机理。在研究溴氰虫酰胺原药对斑马鱼胚胎早期氧化应激作用的基础上,采用DAPI染色和单细胞凝胶电泳(singlecellgeleletrophoresis,SCGE)技术研究其对斑马鱼胚胎细胞DNA损伤的影响;利用吖啶橙染色、TUNEL染色、AnnexinVFITC/PI双染色、JC-1染色流式细胞术结合RT-qPCR技术,研究溴氰虫酰胺原药对斑马鱼胚胎发育毒性及对斑马鱼整体胚胎和24 hpf胚胎细胞凋亡影响;初步解析其对斑马鱼产生发育毒性作用和遗传毒性的调控机理。试验结果表明:1氯虫苯甲酰胺三种剂型对斑马鱼胚胎急性毒性96h-LC50分别为水剂>80 mg a.i.·L-1;悬浮剂 96h-LC50 32.34 mg a.i.·L-1 (CL27.92-36.60 mg a.i.·L-1);颗粒剂 96h-LC5025.96 mg a.i.·L-1 (CL24.29-33.59 mg a.i.·L-1)均属低毒,其三者急性毒性 96h-LC50 比较结果为:颗粒剂>悬浮剂>水剂。高浓度悬浮剂与颗粒剂显著(p<0.05)诱导斑马鱼胚胎体长变短,水剂对斑马胚胎体长影响不显著。氯虫苯甲酰胺三种剂型均诱导斑马鱼胚胎心包囊肿、卵黄囊肿,其诱导能力大小为:颗粒剂>悬浮剂>水剂;2用吖啶橙染色与TUNEL染色两种方法确定三种剂型诱导胚胎细胞凋亡的主要部位为心脏、卵黄、肌肉细胞,三者诱导细胞凋亡的能力比较结果为颗粒剂&悬浮剂>水剂。用RT-qPCR技术初步探究氯虫苯甲酰胺三种剂型诱导斑马鱼胚胎凋亡通路,其结果表明三种剂型均可通过p53基因介导的凋亡通路诱导凋亡;3溴氰虫酰胺原药(95%)对斑马鱼胚胎急性毒性为中毒,96h-LC50为1.57mg·L-1,95% 置信区间为 1.45-1.71 mg·L-1;4溴氰虫酰胺原药浓度大于1.00 mg·L-1即会诱导斑马鱼胚胎体长显著变短(p<0.05),浓度大于1.00mg·L-1即诱导斑马鱼胚胎心率显著降低(p<0.05),浓度大于1.41 mg·L-1即会诱导斑马鱼胚胎自主运动频率增加(p<0.05),实验组心包囊肿、卵黄囊肿、脊椎畸形数均高于空白对照;5溴氰虫酰胺处理后24小时的斑马鱼胚胎,SOD酶活、CAT酶活和MDA含量没有显著变化,说明氧化损伤不显著。6用SCGE技术与DAPI染色微核两种方法检测溴氰虫酰胺对24hpf斑马鱼胚胎细胞DNA损伤,结果表明,随着溴氰虫酰胺浓度增加,微核率显著(p<0.05)增加、彗星尾部DNA含量显著(p<0.05)增加、尾距显著(p<0.05)增加,说明溴氰虫酰胺诱导斑马鱼胚胎DNA损伤,且呈较好的剂量-效应关系;7用吖啶橙染色与TUNEL染色实验两种方法确定溴氰虫酰胺诱导斑马鱼胚胎细胞凋亡,观察发现24hpf斑马鱼胚胎凋亡细胞主要集中在脊椎处,96hpf凋亡细胞主要集中在心脏部位和脊椎肌肉部位。用流式细胞术检测24hpf斑马鱼胚胎细胞凋亡率与线粒体膜电位变化,结果表明,随着溴氰虫酰胺浓度增加,细胞凋亡率增加,线粒体膜电位显著下降(p<0.05)。且在溴氰虫酰胺大于1.00mg·L-1浓度即诱导斑马鱼胚胎产生凋亡,其细胞凋亡率与线粒体膜电位下降呈负相关,相关系数为0.784;8用RT-qPCR技术研究溴氰虫酰胺对斑马鱼胚胎凋亡相关基因的影响。结果表明,溴氰虫酰胺能通过线粒体凋亡通路诱导斑马鱼胚胎细胞凋亡。其主要通路为溴氰虫酰胺诱导斑马鱼胚胎DNA损伤,引起p53基因上调,从而激活胞质中的Bid基因,促使Bax基因转移到线粒体膜上改变膜通透性,进而引发线粒体膜电位下降,Apaf1与细胞色素结合并激活Caspase-9前体蛋白激活Caspase级联反应诱导细胞凋亡。溴氰虫酰胺诱导促凋亡基因Bax,Bid,p53,puma,Apaf1,Caspase-3,Caspase-8和Caspase-9表达量上调,抗凋亡基因Bcl-2表达下调。