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高强度聚焦超声（High Intensity Focused Ultrasound,HIFU）是一种无创消融肿瘤的新技术,应用于多种肿瘤的临床治疗,其疗效也得到了认可。但是,由于超声能量随传播距离增加而衰减,到达深部治疗区域时,超声能量明显减少,导致消融效果降低。虽然可以通过提高声功率和延长治疗时间来达到消融目的,但这也会对声通道内的正常组织造成损伤,产生相应并发症。为此,有学者提出引入增效剂来改变肿瘤组织的声环境,增加超声能量沉积,从而提高消融效率,降低并发症的发生。此外,一些增效剂也具备成像功能,在HIFU增效的同时能提供影像监控,这对于提高HIFU治疗安全性是至关重要的。但是,增效剂存在靶向效率不高的问题,除在肿瘤组织中聚集外,也在肿瘤周边正常组织中聚集,这会导致HIFU治疗时损伤肿瘤周边正常组织。因此,在HIFU治疗中,如何提高增效剂的靶向效率是亟待解决的问题。课题组前期利用厌氧双歧杆菌对肿瘤乏氧区的靶向性来运载增效剂用于提高HIFU消融效率,取得了一定的成果。但以往研究着重在细菌表面直接进行修饰以连接增效剂,这会对细菌活性造成影响,降低其在肿瘤部位的聚集。在本研究中,我们基于双歧杆菌的肿瘤靶向性和适配体对双歧杆菌的特异性,利用“两步法”靶向递送双歧杆菌特异性适配体（AP）修饰的载全氟己烷（PFH）的聚乳酸-羟基乙酸（PLGA）纳米粒（AP-PFH/PLGA NPs）至肿瘤组织中,以进行超声成像及增效HIFU治疗,为生物靶向成像与HIFU治疗提供一种新的策略。目的探讨AP-PFH/PLGA NPs靶向性、安全性、超声成像能力以及能否提高HIFU治疗肿瘤的效率。方法1.AP-PFH/PLGA NPs的制备及基本特性表征:通过双乳化法制备PFH/PLGA NPs,利用碳二亚胺法将AP缀合在PFH/PLGA NPs表面制备AP-PFH/PLGA NPs。检测AP-PFH/PLGA NPs粒径、电位、形态。利用流式细胞仪检测PFH/PLGA NPs和AP的结合率。通过CCK-8法和溶血实验检测AP-PFH/PLGA NPs的体外毒性。血常规、血生化检测以及重要脏器组织病理分析评价纳米粒的体内安全性。激光共聚焦扫描显微镜和流式细胞仪检测双歧杆菌与AP-PFH/PLGA NPs体外连接情况。2.双歧杆菌的肿瘤靶向性及安全性验证:建立BALB/C裸鼠MDA-MB-231移植瘤和BALB/C小鼠4T1移植瘤模型,静脉注射双歧杆菌后,取肿瘤、心、肝、脾、肺和肾组织制成匀浆,涂布在BL培养基上,观察并计数各个组织中双歧杆菌生长情况,以验证双歧杆菌的肿瘤靶向性。注射双歧杆菌后,监测裸鼠体重变化、血常规和血生化指标以及重要脏器组织病理分析,以评估双歧杆菌体内安全性。3.AP-PFH/PLGA NPs靶向性验证:建立裸鼠MDA-MB-231移植瘤模型,随机分为3组:（1）AP-PFH/PLGA组、（2）BF+PFH/PLGA组、（3）BF+AP-PFH/PLGA组。（1）组注射PBS,剩余2组注射双歧杆菌,每天1次,共3次。第三次注射后第7天,（1）组和（3）组静脉注射Di R-AP-PFH/PLGA NPs,（2）组注射Di R-PFH/PLGA NPs,在不同时间点拍摄活体荧光图像。注射纳米粒48h后,收集肿瘤和主要器官,进行离体荧光观察。此外,注射Di I标记的纳米粒后,不同时间点取肿瘤制作冰冻切片,在激光共聚焦扫描显微镜下观察纳米粒在肿瘤中聚集情况。4.AP-PFH/PLGA NPs超声成像:（1）体外超声成像:在HIFU辐照前后,使用超声诊断仪在B模式和CEUS模式下采集PBS、AP-PLGA NPs、PFH/PLGA NPs和AP-PFH/PLGA NPs的图像。随后,通过DFY软件定量测量感兴趣区域（ROI）内的平均回声强度。（2）体内超声成像:建立裸鼠MDA-MB-231移植瘤模型,随机分为3组:（1）AP-PFH/PLGA组、（2）BF+PFH/PLGA组和（3）BF+AP-PFH/PLGA组。（1）组注射PBS,剩余2组注射双歧杆菌,每天1次,共3次。第三次注射后第7天,（1）组和（3）组静脉注射AP-PFH/PLGA NPs,（2）组注射PFH/PLGA NPs。注射24h后,在HIFU辐照（120W,3s）前后使用超声诊断仪在B模式和CEUS模式下采集各组肿瘤组织图像并通过DFY软件定量测量ROI内的平均回声强度。5.AP-PFH/PLGA NPs增效HIFU:建立裸鼠MDA-MB-231移植瘤模型,随机分为4组:（1）PBS组、（2）AP-PFH/PLGA组、（3）BF+PFH/PLGA组和（4）BF+AP-PFH/PLGA组。（1）组和（2）组裸鼠静脉注射PBS,（3）组和（4）组注射双歧杆菌,每天一次,共三次。第三次注射后第7天,（1）组注射PBS,（2）组和（4）组注射AP-PFH/PLGA NPs,（3）组注射PFH/PLGA NPs。注射24h后,进行HIFU消融（120W,3s）,记录消融前后靶区灰度值变化,进行TTC染色、H＆E染色和TUNEL染色评价消融效果。6.HIFU生物靶向消融肿瘤疗效评价:将15只MDA-MB-231移植瘤裸鼠随机分为（1）PBS组、（2）Docetaxel组、（3）HIFU+BF+AP-PFH/PLGA组。（1）组和（2）组裸鼠分别每周注射1次PBS和多西他赛,（3）组每天注射1次双歧杆菌,连续注射3天,第3次注射后第7天注射AP-PFH/PLGA NPs,注射24h后进行HIFU消融（120W,6-9s）。记录治疗后各组肿瘤体积变化以及裸鼠生存期,评价治疗效果。记录裸鼠体重变化和重要脏器H＆E染色评价治疗后的安全性。结果1.AP-PFH/PLGA NPs的基本特性表征:制备的AP-PFH/PLGA NPs具有较高的分散性、良好的球形形态和均匀的尺寸。PFH能成功封装到PLGA中。PFH/PLGA NPs和AP-PFH/PLGA NPs的粒径分别为216.3±19.4 nm和232.4±25.6 nm,zeta电位分别为-17.3±5.49m V和-20.0±3.13 m V。AP与PFH/PLGA NPs具有较高结合率（84.9%±11.1%）。CCK-8结果显示,AP-PFH/PLGA NPs对MDA-MB-231和HUVECs细胞的存活率没有显著影响;溶血实验显示AP-PFH/PLGA NPs未引起明显的红细胞溶血现象;血常规及血液生化分析结果与对照组无明显差异（P﹥0.05）;此外,AP-PFH/PLGA组主要器官的H＆E染色也未见明显病理损伤,这些结果表明,本研究中使用的AP-PFH/PLGA NPs具有良好的生物安全性。激光共聚焦扫描显微镜和流式细胞仪检测结果显示双歧杆菌能成功连接AP-PFH/PLGA NPs且与对照组（4.64%±1.61%）相比,具有较高结合率（81.54%±5.98%）,P＜0.001。2.双歧杆菌的肿瘤靶向性及安全性验证:组织匀浆培养结果表明双歧杆菌在裸鼠MDA-MB-231移植瘤和小鼠4T1移植瘤模型中均表现出良好的肿瘤靶向性。实验组血常规及血生化各项指标与PBS组比较无明显差异（P﹥0.05）,此外,裸鼠心、肝、脾、肺和肾组织的H＆E染色显示双歧杆菌对其无明显损伤,这些结果表明双歧杆菌具有良好安全性。3.AP-PFH/PLGA NPs靶向性验证:活体荧光实验和肿瘤冰冻切片结果均显示,在8h,24h和48h,BF+AP-PFH/PLGA组中纳米粒在肿瘤中的聚集量都显著高于其余两组（P＜0.001）,注射后24h聚集量达到峰值。以上结果表明AP-PFH/PLGA NPs对双歧杆菌具有较好靶向能力,且双歧杆菌能使AP-PFH/PLGA NPs在肿瘤中滞留时间更长。4.AP-PFH/PLGA NPs超声成像:（1）体外超声成像:HIFU辐照前,在B模式和CEUS模式下,各组图像回声强度均无显著差异;HIFU辐照后,由于有PFH存在,PFH/PLGA和AP-PFH/PLGA组图像回声强度发生明显改变。表明PFH经HIFU辐照后,具有良好超声成像能力。（2）体内超声成像:在B模式和CEUS模式下,HIFU辐照前,各组肿瘤区域的图像回声无显著差异;HIFU辐照后,BF+AP-PFH/PLGA组肿瘤区域的图像与另外两组相比明显增强。表明AP-PFH/PLGA NPs能靶向肿瘤中的双歧杆菌从而增强超声成像。5.AP-PFH/PLGA NPs增效HIFU:各组消融后均观察到不同程度的灰度值变化,但BF+AP-PFH/PLGA组变化最明显,与其他组相比差异显著（P＜0.001）。HIFU消融后各组均出现凝血坏死,但BF+AP-PFH/PLGA组凝血坏死体积显著高于其他各组（P＜0.001）。H＆E染色结果表明,与其他组相比,BF+AP-PFH/PLGA组可引起更大面积的肿瘤坏死。TUNEL检测结果显示BF+AP-PFH/PLGA组肿瘤细胞的凋亡指数（AI）显著高于其他各组（P＜0.001）。6.HIFU生物靶向消融肿瘤疗效评价:与对照组相比,HIFU生物靶向消融（HIFU+BF+AP-PFH/PLGA组）具有更高的肿瘤抑制作用。Docetaxel组或PBS组裸鼠的生存时间明显短于HIFU+BF+AP-PFH/PLGA组。HIFU生物靶向消融治疗后,MDA-MB-231移植瘤裸鼠的体重波动可以忽略不计;治疗后,H＆E染色也未发现心、肝、脾、肺和肾组织存在明显的病理损伤,结果表明HIFU生物靶向消融是一种安全有效的肿瘤治疗方式。结论1.制备的AP-PFH/PLGA NPs形态均一,稳定性好,安全性高;AP-PFH/PLGA NPs与双歧杆菌在体外具有较高连接率。2.双歧杆菌对不同肿瘤具有良好的靶向性;AP-PFH/PLGA NPs能高效靶向肿瘤中的双歧杆菌并增强超声成像。3.AP-PFH/PLGA NPs能高效靶向肿瘤中的双歧杆菌从而增效HIFU消融。HIFU生物靶向消融不仅能抑制肿瘤生长,还能显著延长裸鼠的生存期。更重要的是,这种治疗策略并没有产生明显的毒副作用。4.我们成功建立了一种新的治疗方法,为肿瘤的高效、无创治疗提供了一个新的策略。