【摘 要】
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目的1.目前单核苷酸多态性（SNP）分型技术包括一代测序、Taqman探针qPCR、DNA芯片等,针对这类技术存在研发及检测成本高、周期长、结果易出现假阳性的局限性,Li等创建了通用探针为基础的中间引物引发的qPCR（UPIP-qPCR）技术。本研究的目的为开发基于UPIP-qPCR技术的耳聋相关SNP检测试剂盒。2.基因组之间的差异可能是由SNP或拷贝数变异（CNV）引起,CNV的突变率远高于S
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目的1.目前单核苷酸多态性（SNP）分型技术包括一代测序、Taqman探针qPCR、DNA芯片等,针对这类技术存在研发及检测成本高、周期长、结果易出现假阳性的局限性,Li等创建了通用探针为基础的中间引物引发的qPCR（UPIP-qPCR）技术。本研究的目的为开发基于UPIP-qPCR技术的耳聋相关SNP检测试剂盒。2.基因组之间的差异可能是由SNP或拷贝数变异（CNV）引起,CNV的突变率远高于SNP,核酸定量检测基因组的CNV是临床检测的重要指标。利用UPIP-qPCR技术检测肿瘤（乳腺癌、肺癌）相关代谢基因谷胱甘肽S-转移酶（GSTs）同工酶M1、T1（GSTM1、GSTT1）的CNV,对此技术的可行性、灵敏度、分辨率进行分析,并探讨该技术在不同组织样本（肿瘤细胞、肿瘤组织）及大样本中的通用性。方法1.本实验首先以健康人外周血DNA作为模板,选取中国人群中常见的耳聋SNP突变位点为候选SNPs,分别设计UPIP-qPCR特异性引物和金标准Sanger测序的引物,利用UPIP-qPCR技术与Sanger测序同时对比检测,证明该技术的可行性;继而以构建的标准品样本（野生纯合、突变杂合和突变纯合）为模板,利用UPIP-qPCR技术,对耳聋相关SNP位点进行分型验证,证明试剂盒中引物的有效性。2.设计目的基因（GSTM1、GSTT1）及内参基因（GAPDH）的UPIP-qPCR特异性引物和Taqman探针（CNV检测金标准）的qPCR引物,以正常人外周血DNA为模板,通过绝对定量的方法求得DNA样品中基因拷贝数。利用UPIP-qPCR技术对GSTM1基因在不同浓度下进行灵敏度检测、在不同拷贝下进行分辨率检测、在大样本以及不同来源样本（肿瘤细胞、肿瘤组织）中进行CNV通用性检测。结果1.基于UPIP-qPCR技术设计的引物在单一和多重反应得到了特异的扩增信号和典型的扩增曲线,显示健康人耳聋基因为野生纯和型,分型结果与Sanger测序结果一致。通过对标准品的检测,证实该引物和技术可以特异性区分耳聋相关野生纯和型、野生杂合和完全突变型SNP位点。2.UPIP-qPCR与Taqman探针qPCR法（金标准）在健康人目的基因（GSTM1、GSTT1）的拷贝数检测中获得了相同的结果,证明UPIP-qPCR技术可以检测出人基因组CNV,具有可行性。UPIP-qPCR技术可分辨近似拷贝的最精确倍数为1.1倍的CNV,最高灵敏度在0.01ng/10μL,大样本实验中CNV阳性检出率为100%,符合临床大批量检测的需要。通用性实验中UPIP-qPCR在不同来源样本中都能得到检测出GSTM1的拷贝数。结论1.利用UPIP-qPCR技术可完成对耳聋相关基因位点的SNP分型检测,可开发基于UPIP-qPCR技术的耳聋相关SNP检测试剂盒。2.利用UPIP-qPCR技术开发了CNV检测新方法,其具有高准确性、高分辨率和高灵敏度,可在大批量及不同来源肿瘤样本中检测CNV,符合应用于检测肿瘤突变体CNV的要求。
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