在脑缺血再灌注过程中,产生氧自由基等毒性产物攻击DNA和DNA损伤修复系统,两者共同参与脑缺血再灌注损伤的病理过程,保护DNA通常可以减轻脑缺血再灌注损伤。脑缺血再灌注可扰乱脑的氧供和能量代谢,并在早期产生多种毒性产物,造成DNA损伤。如DNA碱基氧化和DNA断裂。DNA断裂包括DNA单链断裂和DNA双链断裂,DNA双链断裂是凋亡的特征,DNA单链断裂是可逆的,其转归是决定受损细胞命运的“门槛”。因此研究在脑缺血再灌注情况下的DNA单链损伤的修复机制具有重要的理论和实践意义。脑缺血再灌注后DNA损伤因子同时也是DNA修复蛋白的破坏因子,从而破坏保护DNA的“第二道防线”。如在缺血再灌注早期APE/Ref-1、Ku70、Ku80迅速下降。提高DNA修复相关蛋白的水平可以减轻DNA的损伤。以上研究表明脑缺血再灌注DNA修复相关蛋白的表达下降是DNA损伤无法修复以至细胞死亡的重要机制。DNA蛋白X线修复交叉互补组1(XRCC1)是DNA单链损伤修复重要的蛋白,在脑缺血再灌注中XRCC1与DNA单链损伤的关系未见研究。氧化应激在脑缺血再灌注DNA损伤与修复中发挥重要作用。研究表明抗氧化干预能够减轻脑缺血再灌注损伤的程度。褪黑素(melatonin Mel)主要在松果体内产生,是体内抗氧化能力非常强的物质,为高效的自由基清除剂和间接的抗氧化剂。近来研究发现褪黑素可能还参与DNA损伤修复,褪黑素干预治疗对于脑缺血再灌注XRCC1表达的影响情况尚不清楚,明确这些问题有利于丰富褪黑素对于脑缺血再灌注保护机制的认识,以便为临床应用提供实验依据。方法:选用250-300g健康雄性Wister大鼠,随机分为三组:(1)假手术组(FO组),5只动物;(2)缺血再灌注组(IR组,大脑中动脉缺血2小时,按再灌注时间不同分为IR10min、1h、4h、12h、24h、48h组),每时相点5只动物;(3)褪黑素干预组(Mel组),每时相点5只动物。采用免疫组化和Western Blot检测XRCC1的蛋白水平;利用单细胞凝胶电泳<WP=9>检测DNA单链断裂;用流式细胞仪检测神经细胞凋亡;透射电子显微镜观察褪黑素干预对脑缺血再灌注后超微结构的影响。计量资料均以均数±标准差表示,组间比较采用方差分析t检验,采用SPSS10.0软件进行统计分析。结果:(一)脑缺血再灌注DNA单链断裂与XRCC1的修复作用1.脑缺血再灌注10min 后,皮质和基底节区DNA单链断裂细胞轻度增加,12h 达到高峰,一直到48h 仍维持在较高的水平;基底节区DNA单链断裂多于皮质区。2.脑缺血再灌注10min 后,即出现凋亡细胞增多,之后持续增加,24h 达到高峰,48h 仍较多;皮质区凋亡细胞少于基底节区。3.脑缺血再灌注10min 基底节区XRCC1轻微下降,1h 后在皮质和基底节区XRCC1明显下降,一直到48h 仍维持在低水平。脑缺血再灌注各时相点皮质区XRCC1多于基底节区。假手术组在皮质、基底节、海马均有明显表达。(二)褪黑素对脑缺血再灌注DNA单链断裂和XRCC1的影响1.单细胞凝胶电泳观察:褪黑素干预组在脑缺血再灌注各时相点DNA单链断裂程度轻于脑缺血再灌注组,但是没有改变原变化趋势。2.用流式细胞仪检测细胞凋亡:与脑缺血再灌注组相比,褪黑素干预减轻脑缺血再灌注神经细胞凋亡的程度。3.用免疫组化和West Blot方法结果显示:与脑缺血再灌注组相比,褪黑素干预减少了XRCC蛋白下降的幅度。4.透射电子显微镜观察:脑缺血再灌注组核膜皱缩,线粒体肿胀空泡样变、髓鞘不规则,分层样改变,胶质细胞增生、有神经细胞“被噬”现象。褪黑素干预神经细胞细胞核膜轻度凹陷,整个核染色质疏松,核周基质较疏松,线粒体增生肿胀,病理改变较缺血组减轻。结论:1.脑缺血再灌注可以导致DNA单链断裂,大量DNA单链断裂诱发细胞凋亡。2.脑缺血再灌注后XRCC1蛋白表达降低,使DNA单链断裂修复功能下降。3.褪黑素干预可以减轻脑缺血再灌注DNA单链断裂的程度。4.褪黑素减少了脑缺血再灌注XRCC1蛋白水平的降低,使DNA单链断裂修复能力增强。