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目的 本研究以骨折愈合不同时期的小鼠骨痂组织为研究对象,观察小鼠胫骨骨折愈合过程的组织形态学变化情况,重点检测骨折愈合中骨痂组织成纤维细胞生长因子受体3(FGFR3)基因的时空表达模式和原位细胞凋亡的发生情况,探讨FGFR3在骨折愈合中可能的作用,探索骨组织石蜡切片的原位杂交技术。方法 野生型昆明白小鼠50只,雄性,6~8周龄,体重22~28g,分为骨折后3d、5d、7d、14d和28d等5个时相点组,每组10只动物。用2.5% Avertin(0.015~0.017ml/g体重)腹腔注射麻醉后,行左侧胫骨髓内钢针内固定术,然后横向剪断胫骨。术后每周行常规X线摄片,分别于骨折后3d、5d、7d、14d和28d等5个时相点以颈椎脱臼法处死小鼠,取出伤侧胫骨,抽出内固定钢针,立即置入4%多聚甲醛磷酸缓冲液中固定,0℃,24h。15%EDTA(PH7.6)脱钙液中脱钙10~14天。确定脱钙完全后,常规脱水、透明,并做石蜡包埋和切片(6μm),用于原位杂交、原位凋亡检测、TRAP染色和HE染色。对照组取材为同一小鼠右侧未骨折的胫骨。结果 X线摄片结果显示,骨折后7d ,骨折断端骨折线清晰可见。到14d,骨折线变模糊,骨折端出现明显的骨痂阴影,钙化骨痂明显可见。第21天,骨折断端之间连接,骨痂膨大,密度增加。28d骨折线完全消失,骨折断端形成骨性连接,皮质骨重建明显。HE形态学染色结果显示,骨折后3d,小鼠骨折局部血肿开始机化,骨折端附近有大量呈编织状排列的梭形细胞浸润。骨折后5d,骨折损伤刺激骨内膜和骨外膜生发层的细胞分化增生,局部大量密集的间充质细胞开始分化。骨折端附近的局部骨膜增厚,密集的间充质细胞增殖并直接分化成成骨细胞。而位于骨折端间隙处肉芽组织中密集的间充质细胞则分化成软骨细胞。到骨折后7d,骨痂主要由软骨细胞组成,皮质骨附近的软骨细胞明显肥大,局部还出现大量新生的骨小梁,其外周可见成骨细胞。骨痂在骨折后14d达到最大,软骨细胞被成骨细胞取代,镜下可见大量新生的编织骨和较成熟的骨组织。骨折后28d,骨折端局部形成骨性连接,骨痂组织完全转变为板层骨,硬骨痂在功能活跃的破骨细胞作用下被大量吸收,骨折愈合进入全面重建。 <WP=10>TRAP染色结果可见,骨折后3~5d骨折端肉芽组织中均无明显的TRAP阳性显色。骨折后7d时,骨折端附近膜内成骨处有部分破骨细胞显色。至14d,骨痂内大量新生的骨小梁周围TRAP阳性显色的破骨细胞明显可见,提示破骨细胞功能活跃。骨折后28d,骨痂内仍有大量TRAP阳性显色的破骨细胞。对照组正常胫骨组织皮质偶见TRAP阳性显色的破骨细胞。原位杂交结果显示,FGFR3 mRNA 阳性细胞表达率在正常对照组为阴性,而在骨折后3d(1.1±0.4%)时较低,到5d(38.5±3.2%)时明显升高,7d(93.6±5.8%)时达到峰值,随后在骨折后14d(5.2±1.7%)时明显下降,到28d时完全消失。光镜下观察可见,骨折后3d,骨折端肉芽组织中几乎没有FGFR3 mRNA阳性表达的细胞。5d时,软骨痂肥大前软骨细胞中出现明显的FGFR3 mRNA信号显示。至骨折后7d,骨痂中的软骨细胞不断分化,在肥大前软骨细胞和肥大软骨细胞中均可见到FGFR3 mRNA强阳性表达。到骨折愈合的中后期(即骨折后14d和28d),骨痂肥大软骨细胞发生凋亡,成骨细胞逐渐取代软骨细胞,此时FGFR3阳性表达信号逐渐消失。整个小鼠胫骨骨折愈合过程中,在硬骨痂细胞中均未检出FGFR3阳性表达信号。对照组正常胫骨组织中也未检出FGFR3阳性表达信号。TUNEL检测可见,小鼠正常胫骨组织的细胞凋亡指数(AI)为2.7±0.6%,而骨痂组织的细胞凋亡指数在骨折后5d(8.3±1.7%)时显著升高,7d(15.6±2.1%)时达到最高,二者均显著高于正常对照组(p<0.05)。骨折后3d组(3.4±0.3%)、14d组(3.8±0.2%)及28d组(3.2±0.4%)与正常对照组比较,细胞凋亡指数差异均不显著。荧光显微镜下观察可见,骨折后3d,血肿区和骨折端肉芽组织中几乎没有TUNEL阳性凋亡细胞。到骨折后5d,骨折端局部TUNEL阳性凋亡细胞增多,以间充质细胞为主。骨折后7d,骨痂TUNEL阳性凋亡细胞非常明显,主要位于骨痂软骨内成骨部位,而新生骨小梁部位未见阳性凋亡细胞。骨折后14d,硬骨痂替代软骨痂,TUNEL阳性凋亡细胞减少,新生骨内偶见少量骨细胞呈凋亡阳性反应。至骨折后28d,偶见个别成骨细胞呈阳性凋亡反应,与正常骨接近并趋于一致。对照组正常胫骨组织偶见TUNEL阳性的凋亡细胞。结论 根据本实验结果,我们可以得出以下结论:发育调节因子FGFR3在骨折愈合中具有重要作用,它主要是通过调节软骨细胞的终末分化而影响骨折愈合。骨折愈合包括骨形成和骨吸收两个方面。骨痂破骨细胞的功能是随着软骨内成骨过程的不断发展而逐渐活跃的;FGFR3通过直接调节骨痂软骨细胞的终末分化而促<WP=11>进软骨内成骨,进而间接参与调节破骨细胞的骨吸收功能。骨痂中的肥大软骨细胞既是TUNEL阳性凋亡细胞,又是FGFR3 mRNA阳性表达细胞,提示FGFR3主要是通过调节软骨细胞的终末分化而诱导肥大软骨细胞凋亡,从而促进软骨内成骨,最终有利于骨折愈合。